家蚕BmDuox基因分析及中肠围食膜蛋白鉴定

【摘要】：双重氧化酶(Duox)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)家族成员,此类氧化酶活化后产生的活性氧(ROS)具有维持机体正常的生理功能的作用。 本文利用RACE技术成功克隆了家蚕双重氧化酶(BmDucx)基因,其cDNA大小为5,545bp,开放阅读框(ORF)长4,503bp,编码1,500个氨基酸残基,N端含有28个氨基酸残基的信号肽序列,5’端非编码区(UTR)长240bp,3'端非编码区长802bp,含有9个典型的ATTTA基序。结构域分析显示BmDuox蛋白N端含有典型的过氧化物酶结构域,钙离子(Ca2+)结合域、铁还原结构域、6个跨膜域、黄素腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结构域。qRT-PCR结果显示BmDuox基因mRNA在家蚕的头部、睾丸和气管中表达水平较高。亚细胞定位结果表明,BmDuox蛋白主要分布在细胞膜附近区域,细胞核中几乎没有信号。BmDuox基因mRNA的表达水平能被细菌和病毒显著地诱导激活。BmDuox基因缺失家蚕突变体生物学试验显示,经口摄入的荧光细菌在肠道中存留数量比对照组显著增加。由此说明,家蚕BmDuox基因在抑制肠道微生物的过度增殖、维持肠道微生物稳态等方面发挥重要作用。 昆虫围食膜(Peritrophic membrane, PM)由中肠上皮细胞分泌,是一层无色透明半透性膜,类似于脊椎动物肠道中的黏膜。它主要由蛋白质、蛋白多糖和几丁质组成。PM位于肠道内容物和中肠上皮之间,具有防止肠道上皮细胞受到外来食物的机械性损伤、阻止病原微生物和毒素的侵入等作用。 本文利用shotgun技术对家蚕PM总蛋白进行了质谱分析,共鉴定了47种蛋白质。功能分析发现其中大部分的蛋白与催化活性、结合活性和转运活性有关,且参与代谢过程和先天免疫途径。进一步对其中两种新发现的蛋白基因(BmMtch和BmPM-24)进行了研究。结果显示PM蛋白基因BmMtch cDNA ORF长888bp,编码295个氨基酸残基。结构域分析其含有两个Mito_carr结构域和三个跨膜区。BmMtch基因在家蚕五龄幼虫脂肪体转录水平较高。Western blotting结果证实它确实在中肠和PM总蛋白中存在。BmMtch没有几丁质结合域,是家蚕PM的一种新的组成蛋白。另一种PM蛋白基因BmPM-24cDNA ORF长684bp,编码227个氨基酸残基,在其N端含有15个氨基酸残基的信号肽序列。Western blotting分析均能在中肠和PM中均能检测到其特异性条带。qRT-PCR结果显示BmPM-24基因主要在中肠、脂肪体和马氏管中表达。BmPM-24也没有几丁质结合域。 昆虫PM的蛋白质组成及其功能的深入研究,将有助于深入了解其潜在的生物学功能,并有助于高效生物杀虫剂的研发。