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家蚕BmNPV ODV-E56/BmP95的生物学功能及多角体包埋外源蛋白的研究

相兴伟  
【摘要】:杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的病原微生物,在感染周期中产生两种表型不同但遗传物质完全一样的病毒形态,即出芽型病毒(Budded virus, BV)和包涵体衍生型病毒(Occlusion-derived virus, ODV).家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)是引起家蚕病毒病的主要病原,在感染后期产生大量的多角体蛋白,并在细胞核内聚合、组装成为超大分子的多角体蛋白结晶。这种多角体结构能有效地保护内部的ODV病毒粒子抵御外部恶劣环境。本论文研究了BmNPV ODV中两种关键的囊膜蛋白ODV-E56和BmP95(ORF69),阐明了它们在ODV病毒粒子包埋入多角体以及经口感染过程中的作用。此外,通过与囊膜蛋白基因的融合表达和基因共表达等技术探讨了BmNPV多角体对外源蛋白的包埋特性。主要结论如下: 1. BmNPV ODV囊膜蛋白ODV-E56的研究 编码该囊膜蛋白的odv-e56位于BmNPV基因组118,837-119,964nt,全长1,128bp,编码375个氨基酸残基,预测分子量41kDa,在其C-端存在一段高度疏水的氨基酸序列。5'RACE分析表明odv-e56转录起始于ATG上游-14bp处的ATAAG的第3个核苷酸A。RT-PCR分析显示BmNPV感染细胞12h-96h均可检测到odv-e56的表达,这些结果表明odv-e56为一个晚期表达基因。 利用同源重组技术成功敲除了odv-e56,发现缺失odv-e56的病毒突变体不影响BV的产量和感染力,也不影响病毒DNA的复制。进一步分析发现敲除该基因仍能形成成熟的ODV,而且能清晰地观察到多角体内包涵有大量的ODV病毒粒子。生物学分析表明,通过血淋巴注射缺失odv-e56的重组病毒可正常感染家蚕,但经口添食缺失odv-e56的多角体却不能引发有效的感染。以上结果说明,ODV-E56与病毒的复制无关,却是经口感染所必需。我们将其称作经口感染因子5(PIF-5)。 2. BmNPV ODV囊膜蛋白BmP95的研究 BmP95位于BmNPV基因组62,249-64,768nt,全长2,520bp,编码一个含839个氨基酸残基的蛋白。在已测序的57种杆状病毒中都含有BmP95及其同源物。生物信息学分析表明BmP95的N-端存在一段高度疏水的跨膜域,含有Pfam:Baculo_VP91_N和几丁质结合域ChtBD2两个功能域。 利用大肠杆菌λ-Red同源重组系统和杆状病毒Bac-to-Bac系统成功构建了敲除BmP95的重组Bacmid。分析发现缺失BmP95后不能产生子代BV病毒粒子,却不影响病毒DNA的复制。进一步分析表明敲除BmP95导致形成异常的核衣壳,从而阻碍了BV的产生、ODV的成熟以及其随后包埋进入多角体的过程。在多角体蛋白基因位点重新补回全长的BmP95可以修复这种表型缺陷,而仅用含有功能域的N-端区域却无法修复。这些结果说明全长的BmP95为核衣壳精确组装所必需。 3.病毒多角体对外源蛋白的包埋特性 从病毒多角体内包涵大量ODV病毒粒子得到启发,产生了能否利用病毒囊膜蛋白信号引导外源蛋白包埋入多角体的设想。利用odv-e56和odv-e25两种ODV囊膜蛋白基因与绿色荧光蛋白基因egfP进行融合表达,能在多角体中检测到融合蛋白。为了验证这种外源蛋白的包埋是否都需要ODV囊膜蛋白信号的引导,将egfP和半乳糖甘酶基因LacZ与多角体蛋白基因进行共表达,发现外源蛋白也可以同样被包埋入多角体。进一步利用一种不形成多角体、却可以大量表达EGFP的重组病毒与野生型BmNPV共同感染家蚕BmN细胞,发现形成的多角体中也含有EGFP.由此认为,BmNPV多角体对细胞核内的外源蛋白的包埋存在非特异性,即外源蛋白的含量越高被包埋入多角体的概率就越大。


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