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稻飞虱化合物感觉系统和代谢酶的分子解析

周文武  
【摘要】:化合物感觉系统(嗅觉和味觉为主的化学感觉)和代谢酶系统在植食性昆虫对生境化合物(外源的如植物化感物质、杀虫剂、环境有毒物质和环境污染物等;内源的如昆虫的各种代谢化合物)的适应中扮演关键角色:前者以高分辨度的特性调控个体的栖息地搜寻、寄主搜寻、聚集、趋避和繁殖等行为;后者以高度特化的功能调节个体对内源和外源化合物的代谢,维持生理稳态的平衡。对这两大系统的解析是昆虫-植物互作关系研究的热点,也是探索农业害虫可持续控制策略的重要内容,而当前大规模测序技术的进步为这两大系统的分子解析提供了新的支持。三种稻飞虱——褐飞虱Nilaparvata lugens Stal,灰飞虱Laodelphax striatellus Fallen和白背飞虱Sogatella furcifera Horvath是亚洲水稻种植农业系统内最主要的一类害虫,对其生态适应能力的研究是农业害虫研究领域持续的热点和难点。基于这三种稻飞虱的多个转录组数据库的构建,以及褐飞虱基因组测序的完成,本论文就这三种飞虱的两大生境适应系统开展系统的分子解析,并取得以下主要结果: (1)从基因组的水平明确了褐飞虱的化合物感觉系统的主要成分的基因家族构成。鉴定了褐飞虱该系统的4个功能元件的基因家族:11个气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)、17个化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)、49个嗅觉受体(odorant receptor, OR)、1个嗅觉辅助受体(odorant receptor co-receptor, Orco)和10个味觉受体(gustatory receptor, GR)。本研究发现,褐飞虱是已知基因组的昆虫中化合物感觉系统在分子水平最简单的物种。作为典型的单食性昆虫,褐飞虱的化合物感觉系统针对单一寄主水稻的进化体现在:GR家族在基因数量扩张上十分匮乏,但其有限的基因可能仍保留了几大基本的味觉功能,如对甜味(糖类)、苦味、气体和性信息素类似物等的识别;OR家族和OBP家族的基因数量扩张相对简单,前者具有独特的基因亚族扩张;CSP家族的基因数量显著扩张,是首次发现的CSP数量多于OBP的昆虫,为这两个基因家族进化关系的认识提供了重要依据;化合物感觉系统基因的内含子在数量和大小上均高于其他昆虫物种。 (2)从转录组的水平明确了灰飞虱和白背飞虱的化合物感觉系统的主要成分;分析了三种稻飞虱体内该系统基因的时空表达特征;分析了水稻条纹叶枯病毒对载体昆虫灰飞虱的该系统基因表达的影响。在三种稻飞虱转录组水平鉴定了27个OBP、31个CSP和2个Orco。三种稻飞虱的OBP和CSP十分保守,在遗传上受到强烈的纯化选择,在触角特异表达的基因数很少,大部分基因在头部(去除触角)、足和躯体(去除足和头部)内表达丰富,推测稻飞虱的这两类蛋白参与非嗅觉识别的生理功能。褐飞虱和灰飞虱的Orco之间仅存在数个氨基酸残基的差异,体现两者对寄主挥发物的协同进化。携带水稻条纹叶枯病毒使灰飞虱雌成虫和三龄若虫体内OBP和CSP的表达水平显著提高,并使带毒雌成虫对稻苗的敏感性提高,而对雄虫的影响在分子和行为水平均没有雌虫剧烈。 (3)从基因组的水平明确了褐飞虱的谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase, GST)基因家族的构成;从转录组水平鉴定了灰飞虱和白背飞虱GST基因;分析了这些基因的时空表达特征和受生境因子影响的特性;对褐飞虱GST基因的表达进行了RNA干扰研究;检测了水稻条纹叶枯病毒对灰飞虱GST基因表达的影响。从褐飞虱基因组中鉴定了11条GST功能基因,2条假基因,在灰飞虱和白背飞虱的转录组中各鉴定了9个基因。褐飞虱的GST家族基因数少于其他已知基因组的昆虫,特别是与外源化合物代谢有关的Delta和Espilon亚家族基因,内含子数量长度均大于其他昆虫。三种稻飞虱GST家族涵盖5个亚家族,存在高相似度的直向同源基因,基因的时空表达类似,但对杀虫剂诱导的反应不同。稻飞虱GST基因的表达倍数提高均在10倍以内,大部分在1.5倍至4.5倍之间。对褐飞虱NIGSTe1和NlGSTm2表达干扰后能显著提高其对有机磷类杀虫剂毒死蜱的敏感性。携带水稻条纹叶枯病毒的灰飞虱体内,LsGSTs3的mRNA水平显著提高,推测GST系统可能参与两者的互作。取食不同品种的水稻之后,褐飞虱体内GST基因的表达也受诱导而改变。 (4)从转录组水平鉴定了三种稻飞虱的细胞色素P450单加氧酶(cytochromeP450monooxygenase, P450)基因,对其时空表达进行了分析。在三种稻飞虱转录组中共鉴定154个P450基因序列,分属4个组的16个家族。在直向同源基因的进化比较上,灰飞虱和白背飞虱的相似度较高。P450基因表达量在若虫期和长翅型成虫体内较高,卵期次之,短翅型成虫最少。体现了褐飞虱化合物代谢的复杂性和P450的功能多样性。在组成型表达上,与内源化合物代谢相关的CYP2组和线粒体组P450基因的表达水平较高,而与外源化合物代谢相关的CYP6家族表达水平较低。 (5)对灰飞虱OBP进行了原核表达和纯化,选取关键基因LsGSTe和LsOrco,构建能表达双链RNA的转基因水稻。构建了灰飞虱的7个OBP的原核表达菌株,探索并确定了这些蛋白表达的最佳条件,初步纯化了其中的两个蛋白LsOBP5和LsOBP7。将灰飞虱若虫限制在对其关键基因LsGSTe具有RNA干扰作用的转基因水稻叶片上取食48小时和96小时后,在虫体内均检测到靶标基因的mRNA水平显著下降;将灰飞虱若虫限制在对其关键基因LsOrco具有RNA干扰作用的转基因水稻叶片上取食48小时和96小时后,检测到其体内靶标基因的表达产物下降,而若虫对水稻的选择行为也受到影响。 综上所述,本研究从基因组、转录组水平对三种稻飞虱化合物感觉系统(嗅觉和味觉)和代谢酶系统(GST和P450)进行了分子解析,研究了其时空表达特性及受病毒、杀虫剂、水稻品种等因子的调节特性,对主要功能基因进行了原核表达和纯化,对关键基因进行了RNA干扰的功能验证,成功构建了具有干扰效果的双链RNA转基因水稻,为后续的研究提供了重要的支持。


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