沟叶结缕草愈伤组织再生体系的优化

【摘要】：沟叶结缕草(Zoysia matrella [L.] Merr.)又名马尼拉,是一种优良的暖季型草坪草,被广泛应用于暖温带及过渡地区。因其无法产生种子,故在自然界通过匍匐茎进行无性繁殖,无法采用杂交育种等传统方法进行遗传改良。因此,转基因及体细胞无性系变异等生物技术在沟叶结缕草育种、抗性和观赏性改良中有着重要的作用。 本试验以继代了8年的沟叶结缕草匍匐茎所诱导的胚性愈伤组织为材料,比较了不同生长调节剂(BA和ZR)及其浓度(0.00、0.05、0.10、0.20、0.40mg/L)组合、不同氨基酸种类(L-Pro、 L-Arg、 L-Glu)、不同固化剂种类(Phytagel. Gelzan、 Agar、 Carrageenan、 Agargellan)、不同接种大小(1、2、3、4mm)、不同培养容器(柱形瓶、三角瓶和培养皿)以及不同辐射剂量(0、20Gy)的60Coγ射线对愈伤组织再生的影响,以优化沟叶结缕草胚性愈伤组织的再生条件。同时,对愈伤组织再生过程进行了超微结构观察以更深入了解其再生。主要研究结果如下： 1.沟叶结缕草胚性愈伤组织再生率随着生长调节剂的改变而发生明显改变,随着生长调节剂浓度从0.00提高至0.40mg/L,胚性愈伤组织再生率在2.5%-70.0%之间变化。低浓度(0.05mg/L)的BA能够刺激愈伤组织再生,而随着BA浓度的增加,愈伤组织的再生率显著降低；另一方面,在未添加BA的培养基上,胚性愈伤组织的再生率随着ZR浓度的提高并未表现出显著性差异。结果显示在含有0.05mg/L的BA和ZR培养基中,胚性愈伤组织的再生率达到最高(70.0%),且平均总不定芽数最多(109.5)。 2.含有500mg/L L-Glu培养基上其再生率(18.0%)与对照组的再生率(30.0%1未存在显著差异(p0.05),而添加同浓度L-Arg和L-Pro显著抑制了愈伤组织的再生(p0.05),其中在含有L-Arg的培养基上再生率及再生力最低,分别为8.0%和74.5% 3.在含不同固化剂的再生培养基上,胚性愈伤组织的再生力差异并不显著。Agargellan上的胚性愈伤组织显示最高的再生率(39.0%),Agar及Carrageenan培养基上的愈伤组织再生率分别为32.0%、27.0%,与Agargellan上并无显著差异(p0.05),然而,常用的Phytagel培养基上愈伤组织再生率仅为19.0%,此外,无论是Sigma公司还是CP Kelco公司,所产的Gelzan都显示出较低的再生率(分别为21.0%、12.0%)。 4.试验结果显示,当胚性愈伤组织接种直径分别为1mm、2mm、4mm时,再生率没有显著差异,分别为21.0%、19.0%、18.0%,与接种直径为3mm的胚性愈伤组织的再生率(68.0%)具有显著性差异。 5.试验在柱形瓶中观测到最高的再生率(64.0%),与三角瓶(7.0%)和培养皿(13.0%)中的具有显著性差异,而三者再生力之间并无显著性差异。 6.辐射剂量为20Gy时,胚性愈伤组织具有更强的细胞分裂能力,膨大至5mm的愈伤组织小块能达到95.0%,远远大于未经辐射的胚性愈伤组织(80.0%)。但其胚性愈伤组织的再生率(20.0%)显著(p0.05)低于未经辐射处理的愈伤组织(71.0%)。 7.电镜扫描显示沟叶结缕草胚性愈伤组织发生属于体细胞胚发生途径,其过程与狗牙根等暖季型草坪草的发生相似。电镜观察发现,胚性愈伤组织结构紧密,细胞较小,细胞内含物丰富,细胞代谢旺盛,且胚性愈伤组织在分化过程中细胞形态存在很大差异。