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海洋黑曲霉生产耐盐型纤维素酶和β-葡糖苷酶及其酶学性质研究

薛栋升  
【摘要】:纤维素酶是将纤维素降解为葡萄糖的酶,由内切酶、外切酶和p-葡糖苷酶组成。p-葡糖苷酶将纤维二糖降解为葡萄糖,是酶解纤维素过程中的关键步骤之一。耐盐纤维素酶可以在高盐环境下高效降解纤维素,造纸和纤维素预处理废水的治理,海洋垃圾、海藻和海草中纤维素的高效利用,盐碱地的修复等需要耐盐的纤维素酶。 本论文从海洋中筛选产耐盐纤维素酶的菌株,通过对具有良好耐盐性能的纤维素酶和p-葡糖苷酶的发酵工艺、酶学性质、普遍的耐盐机制等的研究,为高盐环境中纤维素的降解打下基础。论文研究包括以下内容: 首先,从海洋中筛选得到产耐盐纤维素酶的真菌,根据该真菌的形态,ITS序列和5%NaCl (w/v)最适生长盐度,鉴定该真菌为嗜盐海洋黑曲霉。海洋黑曲霉产生的纤维素酶最适温度和pH为58℃和4.5,在12%NaCl (w/v)溶液中的酶活最大,是在无NaCl溶液中酶活的1.33倍。该纤维素酶在黑液废水中降解纤维素,降解12h产生的葡萄糖比在自来水中降解纤维素产生的葡萄糖多了11.5%。研究结果表明,海洋黑曲霉产生的纤维素酶是一种具有良好耐盐耐热性能的纤维素酶。 其次,研究了纤维素酶的固体发酵工艺,实现了纤维素酶的环境友好型生产。固体发酵的天然培养基最优组成为:76.9%水葫芦(w/w),8.9%玉米芯(w/w),3.5%稻草粉(w/w),10.7%麸皮(w/w)和干固体基质2.33倍的天然海水。天然海水中的主要无机盐都能增加纤维素酶的产量。发酵144h,纤维素酶的酶活达到17.80U/g干固体基质。 第三,研究了液体发酵时海洋黑曲霉纤维素酶酶活和胞外蛋白表达对不同碳源的响应。海洋黑曲霉纤维素酶的酶活和胞外蛋白对不同碳源的响应有较大差异。在以玉米芯或稻草秆作为碳源时,液体发酵产生的内切酶、β-葡糖苷酶和纤维素酶的酶活分别为2.00U/mL和1.70U/mL、3.25U/mL和2.62U/mL、0.13和0.08U/mL,比活力分别为1.39U/mg蛋白和1.31U/mg蛋白,3.25U/mg蛋白和2.62U/mg蛋白,0.181U/mg蛋白和0.165U/mg蛋白。二维电泳分析表明,以玉米芯或稻草秆作为碳源时,海洋黑曲霉产生的胞外蛋白的种类差异达到15种。 第四,用丝瓜囊作为固定化载体固定海洋黑曲霉,连续批次发酵生产p-葡糖苷酶。丝瓜囊固定的菌丝量达到3.1g/L,固定效率达到95%以上。固定化发酵缩短了发酵周期,达到最大产量的时间由游离发酵的7d降为固定化发酵的4.5d。固定化发酵的第3、4批次的产量高于游离发酵的产量,固定化连续5批次发酵的p-葡糖苷酶产量均高于110U/mL。 第五,研究了p-葡糖苷酶在不同盐度下的酶学性质和热失活动力学。粗p-葡糖苷酶在6%NaCl(w/v)溶液中的酶活最高。在0%和6%NaCl(w/v)溶液中的最适温度和pH相同,都为66‰和5.0。在6%NaCl(w/v)溶液中的酶活是在无NaCl溶液中的1.46倍。在62℃,65℃,67℃和70℃,p-葡糖苷酶在6%NaCl (w/v)溶液中的半衰期均高于在无NaCl溶液中半衰期的2倍以上。p-葡糖苷酶在6%NaCl (w/v)溶液中的热失活自由能比在无NaCl溶液中的热失活自由能和熔点温度分别高了约2kJ/mol,熔点温度也略微提高。纯化后测得p-葡糖苷酶的分子量约为110kDao在高盐度环境下,纯p-葡糖苷酶的酶活和半衰期的增长与粗p-葡糖苷酶酶活和半衰期的增长相似。研究结果表明该海洋黑曲霉产生的p-葡糖苷酶是耐盐耐热型p-葡糖苷酶。 第六,构建了p-葡糖苷酶的分子模型,探讨了该类酶的耐盐机制。建立了该类酶的分子模型,大量的谷氨酸和天冬氨酸残基分布在分子模型表面。在分子表面的大量酸性氨基酸残基赋予p-葡糖苷酶高负离子型表面,高负离子型表面和分子内核的作用可能增强了p-葡糖苷酶在高盐环境下的热稳定性。p-葡糖苷酶在高盐度下活性增加的原因可能是高盐的环境使p-葡糖苷酶异构化,异构体的催化位点更容易与底物纤维素二糖作用。 本论文对耐盐纤维素酶和β-葡糖苷酶的高效生产,高盐环境下纤维素酶和p-葡糖苷酶性质、p-葡糖苷酶耐盐机理等的研究,对高盐环境下的纤维素的高效降解具有重要的意义。


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