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褪黑激素受体MT1活化的信号转导机制研究及内含肽介导的新型GPCR活化检测模型构建

陈林洁  
【摘要】:G蛋白偶联受体作为细胞膜上最大的一类膜蛋白,在被配体活化后参与了许多重要的生理病理功能。本论文以褪黑激素受体MT1和趋化因子受体CCR5为研究对象,分别对GPCR的信号转导和GPCR的活化检测模型构建两大方面做了基础研究。在针对MT1信号转导的研究中,我们发现MT1除了已报道结合Gi蛋白的同时,也能结合Gs蛋白并引起cAMP/PKA/CREB信号通路的活化。我们探索了MT1结合Gs的分子机制,确定了受体胞内第二环以及跨膜区NSXXNAXXY基序参与了这一结合,并且这一过程可能发生在脂筏这一细胞膜亚结构上。我们进一步探索了MT1同时结合Gs和Gi蛋白在受体失敏内吞和受体活化MAPK/ERK信号通路上的关系,确定了MT1结合Gi蛋白是其内吞的必要条件,并以依赖clathrin的内吞途径进行配体活化后的失敏内吞:MT1介导的MAPK/ERK磷酸化则主要是通过Gi/PI3K/PDK1/PKC途径,此外Gs/cAMP/PKA途径也参与了这一过程。在针对CCR5的活化检测模型构建上,我们以新克隆得到的一条天然断裂的拼接肽selDnaE为基础,实现了包括荧光蛋白和荧光素酶在内的报告蛋白的重组拼接,用以实时监测依赖CCR5活化的细胞融合模型,从而达到筛选拮抗CCR5活化的小分子拮抗剂。这一检测模型的构建为用以抗HIV侵染药物的初筛提供了新的手段。


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