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乙型肝炎重症化过程中microRNA-210的改变及功能研究

宋广忠  
【摘要】:研究目的 乙型重型肝炎病死率高,预后差。寻找可用于早期预示和早期诊断重型肝炎发生的分子标志物是目前病毒性肝炎研究的热点之一。越来越多的证据表明循环microRNAs (cir-miRNAs)可能作为潜在的疾病诊断生物标志物。本课题旨在研究乙型肝炎重症化过程中血清1miRNA表达谱的变化以筛选差异表达的microRNA-210(miRNA-210).评价血清miR-210水平与乙型肝炎重症化进程的关联关系、探讨miR-210在乙型肝炎重症化过程中的潜在功能及其作用机制,为乙型肝炎重症化的早期预测、预防和治疗提供新型靶标。 研究方法 1miRNA芯片实验 (1) miRNA表达谱分析: 用TaqMan(?) Human MicroRNA Array A分析健康人混合血清样本(10例等体积混合)、慢乙肝轻度病人混合血清样本(10例等体积混合)、乙型慢加急肝衰竭病人混合血清样本(10例等体积混合)的miRNAs表达谱。 (2)筛选差异表达]miRNAs: 以(Ct35)且(|△△Ct|≥2)为判定标准,初步筛选可扩增检测到的差异表达的1miRNAs。 (3)候选miR-210的选择:以(Ct35)且(△△Ct≤-2)为判定标准,进一步筛选随着乙型肝炎病情严 重程度表达水平升高的miR-210用于单样本RT-qPCR验证。 2人群调查 (1)血清样本:30例慢乙肝轻度病人血清、30例慢乙肝重度病人血清、30例乙型慢加急肝 衰竭病人血清及30例健康对照血清。 (2)miR-210的再验证:针对miRNA芯片筛选出来的差异表达的miR-210进行单样本RT-qPCR验证。 (3)其他检测指标:肝功能(ALT、AST、TBIL、PTA),血清HBV标记物,病毒载量。 3动物实验经小鼠尾静脉注射Con A (20mg/kg)制备小鼠急性肝衰竭模型,并于注射后 6、12、24小时处死动物,收集外周血和肝组织,检测下列指标: (1)缺氧探针染色:检测缺氧肝细胞。 (2)荧光定量PCR:检测肝组织和血清miR-210水平。 (3)荧光定量PCR:检测小鼠肝组织miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA水平。 4.体外实验 HepG2.2.15细胞分别转染空白对照(DEPC水)、模拟物阴性对照和miR-210模拟物后,缺氧培养24h或48h后检测下列指标: (1) CCK8assay:检测HepG2.2.15细胞线粒体脱氢酶活性。 (2)病毒学指标检测:培养基上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA拷贝数;HepG2.2.15细胞内HBsAg mRNA水平。 研究结果 1miRNA芯片实验结果 (1)血清中可检测到miRNA的数量和表达水平随着病情进展显著增加。 (2)乙型肝炎病人血清let-7b等20个miRNAs表达水平显著高于健康对照组。 (3)血清中miR-210、miR-324-5p、miR-423-5p表达水平随着病情进展显著升高。 2人群调查结果 (1)轻/重度乙型肝炎和乙型慢加急肝衰竭病人血清中miR-210的水平显著高于健康对照组(P0.05),血清中miR-210表达水平随着乙型肝炎病情进展显著性升高。 (2)慢性乙型肝炎患者血清miR-210水平与ALT/AST水平及血清总胆红素水平呈正相关(P0.05),与凝血酶原活动度呈负相关(P0.05)。 3动物实验结果 (1)小鼠肝衰竭进程存在动态缺氧现象。Con A暴露6h组和12h组小鼠肝细胞缺氧率显著性增加(P0.05),Con A暴露24h组小鼠肝细胞缺氧率显著高于Oh组(P0.05),但低于6h和12h组(P0.05)。 (2)小鼠肝组织和血清miR-210表达水平随着病情进展显著升高。 (3)小鼠肝衰竭进程miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA表达水平显著性减少(P0.05)。 4细胞实验结果 (1)缺氧条件下miR-210过表达抑制HepG2.2.15细胞线粒体脱氢酶活性。 (2)缺氧条件下miR-210过表达抑制HBV DNA复制和HBsAg表达。 研究结论 1.miRNA表达谱芯片结果显示:乙型肝炎重症化进程血清中miRNA的数量和表达水平与乙型肝炎病情严重程度有关。 2.肝炎病人调查显示:miR-210对乙型肝炎重症化进程有重要的提示作用,miR-210对乙型肝炎重症化的早期诊断有重要意义。 3.肝炎病人miR-210表达水平升高的内在机制是炎症导致肝细胞缺氧,进而诱导miR-210表达。 4.通过调节线粒体代谢,miR-210在乙型肝炎重症化进程中可能起着重要的保护作用。


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