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弥漫大B细胞淋巴瘤中Notch2受体截短突变的生物学功能研究

张昕霞  
【摘要】:Notch2是Notch受体家族的一员,它是该家族中促进B细胞实现功能的主要受体。Notch2在淋巴瘤的发生发展中具有多种生物学功能,这些功能是通过转录激活Notch2靶基因(如核因子kappaB, Nuclear factor kappa B, NF-κB)实现的。令人感兴趣的是,Notch信号通路和NF-κB信号通路之间具有复杂的相互作用,Notch2能影响NF-κB的表达,而作为反馈NF-κB也能影响Notch2及其信号通路成员的表达。因为Notch2是一种高保守的受体蛋白,所以Notch2突变在淋巴瘤中比较罕见。直到最近,人们才在一些B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)中发现Notch2突变,比如弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和边缘区淋巴瘤(MZL)。DLBCL是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)亚型,它以其组织学异质性和临床表现异质性而闻名。目前,DLBCL的研究热点仍为寻找更好的DLBCL分类方法和治疗策略,这些研究均以在DLBCL发生发展过程中启重要作用的原癌基因(如Notch2)为基础。本研究旨在探索在DLBCL中Notch2受体突变的作用。 首先,在DLBCL核酸样本中,我们对Notch2基因的26号外显子和34号外显子进行DNA测序分析。我们在3例DLBCL样本(共69例)中发现了一个相同的突变,它发生于PEST(proline-, glutamic acid-, serine-and threonine-rich)结构域。该突变位于Notch2cDNA序列的7308位(G/A),它能使色氨酸转变为终止密码子,从而使Notch2受体C末端的PEST结构域缺失部分结构。携带该突变的3例DLBCL样本表达类似的免疫表型,均为Notch2+P50+P65+Ki67+,这些指标预示着这类DLBCL可能具有比较活跃的细胞增殖能力。根据上述测序结果,我们构建Notch2野生型和突变型的表达载体,并将其转染至293T细胞株和淋巴瘤细胞株,包括DLBCL细胞株(Pfeiffer、OCI-ly3和OCI-ly6)和Burkitt's淋巴瘤(Raj、Ramos、 Daudi和Namalwa).其次,通过增殖实验、细胞周期阻滞与释放实验以及细胞凋亡实验,我们发现这类突变的Notch2受体可以促进细胞增殖,加快细胞周期进程和抑制凋亡。再次,免疫共沉淀和萤光素酶报告基因实验的结果显示,相对于野生型的Notch2,突变的Notch2与DNA结合蛋白RBP-Jκ(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region,也称Su(H)、CSL和CBF1)的结合亲和力较强,并且具有更高的转录活性。另外,通过Western Blot. Real-time PCR和萤光素酶报告基因等实验,我们发现Notch2受体突变可以显著激活NF-κB信号通路。通过增殖实验,我们还发现由Notch2突变诱发的快速细胞增殖能被PDTC (ammonium pyrrolidinedithiocarbamate,一种NF-κB信号通路抑制剂)完全逆转。最后,Western Blot结果显示Notch2siRNA能调节NF-κB信号通路的表达水平,而PDTC也能影响Notch2的表达水平。 综上所述,携带Notch2突变的DLBCL可被归类为一种新的DLBCL亚型,它以活跃的细胞增殖为特征。PEST截短的Notch2可通过加快细胞周期进程和抑制凋亡来促进细胞增殖。我们从实验结果推测,这种由截短的Notch2诱导的快速增殖可能与Notch2信号通路和NF-κB信号通路的异常激活有关。本研究希望能给临床治疗DLBCL提供新的治疗方向,抑制Notch2信号通路和NF-κB信号通路可以成为新的肿瘤治疗靶点。


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