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层析介质孔径与配基密度对蛋白吸附性能影响及抗体分离研究

卢慧丽  
【摘要】:层析是目前应用最广泛的蛋白分离方法,介质性能决定了层析分离过程的效率,关注点常集中于介质偶联的功能配基,而孔径和配基密度往往被忽视。本文以抗体分离为目标,探讨两种不同作用机制的层析方法,离子交换层析和疏水电荷诱导层析,制备不同配基密度与孔径的系列介质,比较吸附性能,分析配基密度与孔径的影响。主要结果如下: 以3种不同孔径的琼脂糖凝胶(Bestarose3.5HF、4FF和6FF)为基质,优化配基偶联条件,制备了不同配基密度的阴离子交换层析介质(以diethylamuboethyl, DEAE为配基)和疏水电荷诱导层析介质(以2-mercapto-1-methylimidazole, MMI为配基)。对于DEAE介质,最高配基密度分别达到110、280和410μmol/g;对于MMI介质,分别达到50、110和130μmol/g。 以牛免疫球蛋白(bIgG)和牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,考察了系列DEAE介质和MMI介质的静态吸附性能,并采用Langmuir吸附等温式进行拟合。结果表明,对于DEAE介质,配基密度较低时,增加配基密度有利于蛋白质吸附;密度较高时,吸附量趋于稳定,甚至略有降低;较小孔径介质的比表面积较大,有利于蛋白质吸附;综合考虑孔径和配基密度影响,提出综合参数N,发现两种蛋白的饱和吸附容量均随log(N)呈线性变化。对于MMI介质,配基密度较低时,MMI介质无法有效吸附BSA和bIgG;当单位表面的配基数目较高(15x10-12μmol/μm2)时,介质才能较好吸附BSA和blgG。 考察了系列DEAE介质和MMI介质对bIgG和BSA的动态吸附性能,包括吸附动力学和穿透曲线。采用孔扩散模型对吸附动力学曲线进行拟合,对于DEAE介质,配基密度对有效扩散系数的影响不大,而孔径增大可促进孔内扩散;对于MMI介质,配基密度和孔径增大都可促进蛋白质的孔内扩散,主要原因在于提高了介质与蛋白之间的疏水作用力。根据穿透曲线获得蛋白的动态载量Q10%,系列DEAE介质对BSA动态载量都比较大,总体上随平衡吸附量而线性增大;而blgG动态载量达到最大值时的配基密度有所偏移,分析可能原因在于动态吸附过程降低了bIgG在介质内部孔道的可及区域,减小了介质内部能够与蛋白相互作用的有效配基。MMI介质对BSA的动态载量很小,对bIgG的动态载量则依赖于介质的配基密度和孔径,控制较低操作流速,配基密度较高、中等孔径的MMI-B-4FF-110介质可实现bIgG的高效吸附。 考察了三种MMI介质MMI-B-3.5HF-50、MMI-B-4FF-110、MMI-B-6FF-110对bIgG和BSA混合蛋白的吸附等温线,发现吸附过程存在竞争性,具有优先吸附bIgG的能力,其中孔径适中、配基密度较大的MMI-B-4FF-110介质最佳,对bIgG的饱和吸附容量为93.51mg/g,而对BSA仅为43.69mg/g。进一步考察了MMI-B-4FF-110对混合蛋白的吸附动力学,发现BSA对bIgG的动态吸附影响不大,而当bIgG存在时改变了MMI介质对BSA的吸附,MMI对BSA的吸附量在吸附初始阶段大于其平衡吸附容量,随后逐渐减小到其平衡吸附量,可能是介质对两种蛋白吸附作用的强弱差异造成。 以bIgG为分离目标,考察了MMI介质的分离性能,包括bIgG/BSA混合液中分离bIgG,以及牛血中分离bIgG。对于bIgG/BSA混合液,优化了层析分离的上样和洗脱条件,确定pH7.0上样和pH4.0洗脱,可以获得高纯度的bIgG;比较了不同配基密度和孔径的MMI介质,发现孔径适中、配基密度较大的MMI-B-4FF-110介质效果最好。进一步采用优化的分离条件,利用MMI-B-4FF-110从牛血中分离bIgG,结果表明,牛血经离心和硫酸铵沉淀预处理后,利用MMI介质一步层析分离,bIgG纯度约95%,收率大于85%。 本文以DEAE离子交换层析为常规层析的典型代表,MMI疏水性电荷诱导层析为新型分离方法代表,系统考察了介质孔径和配基密度对bIgG和BSA吸附性能的影响,得到一些规律性认识,并且发现MMI介质对bIgG有优先吸附能力,优化了分离条件,用于抗体的分离纯化。相关结果有助于层析介质的进一步优化设计,提高抗体分离的效率。


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