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抗非特异性蛋白质吸附多肽的合成、表征及体外酶降解性能研究

杨庆华  
【摘要】:生物材料与普通的材料的一个根本区别在于其生物相容性。生物相容性不仅包括组织相容性,不会使组织产生炎症甚至免疫原性;而且包括血液相容性,即不会产生凝血和血栓现象。聚乙二醇(PEG)是为数不多的经过美国食品药品监督管理局(FDA)批准能够应用于临床的医用生物材料,但是已经证明其在长期体内环境条件下容易氧化,失效甚至引起血栓等严重后果。传统两性离子材料如聚甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(pMPC)、聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(pSBMA)和聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(pCBMA)具有优良的抗非特异性吸附性能和生物相容性,但是由于其甲基丙烯酸酯类的聚合物骨架不能生物降解,这限制了它们在药物与基因载体等领域的应用。因此,我们开发了若干具有优异抗非特异性蛋白质吸附性能的多肽,并综合考察了它们的各种性能,尤其是酶降解性能。主要的内容和结论包括以下几个部分: 1、以Nε-苄氧羰基-α-叔丁基-L-赖氨酸盐酸盐(H-Lys (Z)-OtBu.HCl)和δ-苄基-N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸(Boc-Glu(Z)-OH)作为起始原料,合成了具有均一正负电荷分布的多肽(poly(EK),对应二聚体称dimer1)抗非特异性蛋白质吸附材料,解决了N-羧基环状酸酐(NCA)单体混聚所产生的不均一性和PEG类和甲基丙烯酸酯类材料的生物不可降解性问题。核磁共振图谱(1HNMR)和凝胶渗透色谱(GPC)检测结果表明已经成功得到不同分子量的poly(EK).以dimer1作为原料,典型的poly(EK)收率为45%左右。衰减全反射傅立叶转换红外光谱(ATR-FTIR)、X-射线光电子谱(XPS)以及椭圆偏振光谱仪(Ellipsometer, ELL)检测结果表明在金片表面存在多肽的自组装单分子膜(SAMs). ELL测定的SAMs膜厚大约只有几纳米,且随着多肽的分子量呈非线性增加。以TCPS表面作为对照,SAMs表面对anti-IgG和Fg的最低相对吸附量只有5.1±1.6%和7.3±1.8%,表明该多肽具有良好的抗非特异性蛋白质吸附性能。没有发现明显的细菌和细胞吸附。在5mg/mL情况下,poly(EK)没有发现明显的细胞毒性和溶血现象。 2、以α-苄基-Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸盐酸盐(H-Lys(Z)-OBzl.HCl)和α-叔丁基-N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸(BOC-Glu-O'Bu)作为起始原料,我们合成了一种具有聚谷氨酸骨架带赖氨酸侧链的多肽(poly(E)-K,对应二聚体称dimer2)。1HNMR和GPC的检测结果表明得到了不同分子量的目标多肽。以dimer2作为原料,典型的poly(E)-K的收率为40%左右。ATR-FTIR、XPS以及ELL的检测结果都证实了金片表面存在多肽SAMs.以TCPS表面作为对照,该多肽SAMs (3.5kDa)对anti-IgG和Fg的最低吸附量只有3.3±1.8%和4.4±1.6%,具有比poly(EK)更好的抗非特异性蛋白质吸附性能。在5mg/mL的情况下,poly(E)-K也没有发现明显的细胞毒性和溶血性能。在溶血性实验中,poly(E)-K的吸光度甚至低于阴性对照组PBS的吸光度,表明它对细胞膜的作用很小,甚至可能还有一定的保护作用。 3、预备实验发现,由a-氨基和α-羧基正常接肽的poly(EK)可以被胰蛋白酶降解;而聚合物骨架与侧链之间通过γ-羧基与a-氨基非正常接肽而成的poly(E)-K,则不能被胰蛋白酶降解。在此基础上,通过调节两种二聚体的比例,缩合得到不同比例的混聚多肽。]HNMR的检测结果表明,已经成功得到不同比例的混聚多肽。初步酶降解实验结果显示,随着poly(E)-K的比例不断增加,混聚多肽的酶降解时间有一定程度的延长。因此,通过调节混聚多肽的组成,可以方便调控其酶降解速度和时间,这在药物/基因控制释放,以及组织工程等方面有广阔的应用前景。


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