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Notch信号通路介导脓毒症脑病的作用及机制研究

黄曼  
【摘要】:脓毒症脑病又称脓毒症相关性脑病(Sepsis-associated encephalopathy, SAE)是脓毒症引起的弥漫性脑功能障碍,其发病率为8%-70%。临床研究发现,SAE是ICU中最常见的脑病之一,并发SAE可导致脓毒症患者的死亡率明显增高。SAE病理生理机制较复杂,其发病机制尚不明确,但是大量的研究结果表明神经元凋亡是SAE发生及发展过程的重要表现之一。研究证实,在脓毒症大鼠模型中,SAE可导致大鼠长期的记忆损伤。其中,与空间记忆密切相关的海马等脑区的损伤程度尤为明显。 本研究以Notch信号通路为主要研究对象,探讨SAE发病机制。Notch信号通路是调控神经元凋亡的关键信号通路之一。最新研究表明,γ-分泌酶复合体和Notch1参与了一些神经变性疾病的发病过程,如阿尔茨海默病、缺血性脑卒中等。同时,Notch信号通路特异性抑制剂DAPT可有效抑制凋亡和炎症反应介导的脑缺血性损伤,其作用机制与Notch信号通路在PARP-1激活凋亡过程中起到调控作用有关。新近研究发现,PARP-1激活后通过自身分裂和核内凋亡相关因子,活化caspase通路,从而导致神经元的凋亡。 本研究以盲肠结扎穿刺法(CLP)建立大鼠的脓毒症模型,集中开展了Notch信号通路在SAE中的作用及其机制研究。研究表明,CLP后24小时,Notch受体细胞内区域(NICD)表达显著增加,大鼠海马组织炎症反应、神经元凋亡、神经元死亡等也明显增加。DAPT能明显减少海马组织神经元凋亡和死亡,以及TNF-αIL-lb、IL-6、PARP-1和Caspase-1的表达。同时,CLP引起NF-kB转核作用也可被DAPT明显抑制。 综上所述,Notch信号通路参与了脓毒症导致的脑损伤,其作用机制与调控NF-kB转核有关。研究结果可为SAE的治疗提供新的策略和药物靶标。 第一部分Notch信号通路在脓毒症脑病中的作用 目的:脓毒症相关性脑病(SAE)病理生理机制尚不明确,缺乏客观的诊断指标及有效的治疗和预防手段。研究发现γ-分泌酶复合体和Notch1参与了一些神经变性疾病的发病过程,γ-分泌酶抑制剂DAPT能抑制凋亡和炎症反应介导的脑缺血性损伤。本部分选用盲肠结扎穿刺法(CLP)建立脓毒症模型,观察Notch信号通路在脓毒症脑病中的作用及DAPT对脓毒症脑病的保护作用。 方法:取SD大鼠,建立CLP模型,戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉,腹部剃毛并用碘伏消毒,铺巾,沿腹中线剪开2cm腹部切口,暴露盲肠,在回盲瓣远端结扎盲肠,然后用18号针刺穿刺盲肠2次,轻轻挤压盲肠,使少量的肠内容物渗出,然后将盲肠返回到腹腔,关闭腹腔。假手术组(sham)大鼠予剖腹,并将盲肠外置1分钟,不予盲肠穿刺或结扎,然后将盲肠回纳至腹腔并关腹。每只手术操作的大鼠术后每6小时给予皮下注射生理盐水(3ml/100g)及头孢曲松(30mg/kg).实验于麻醉后直视下行股动脉切开置入24G输液管以测定血压、心率。记录术前、术后6h、12h和24h血压、心率和肛温,并在以上时间点经股动脉采血1ml测血乳酸水平(每个时间点,n=3)。59只大鼠随机分为四组:(a)假手术+生理盐水组(10ml/kg);(b)假手术+DAPT组(10μmol/kg):(c)CLP+生理盐水组(1ml/kg);(d) CLP+DAPT组(10μmol/kg)。每组分为2个亚组,第一亚组,24小时处死大鼠,断头取血,分离海马组织,-80℃保存,行NICD的Western-Blot蛋白检测。第二亚组,术后每6小时子皮下注射生理盐水(3ml/100g)及头孢曲松(30mg/kg),并允许自由进食及饮水。术后第7天存活大鼠检测行为学改变(新物体识别实验)。 结果:CLP组大鼠出现蜷缩少动、竖毛,个别大鼠出现偏瘫、癫痫发作表现;并出现平均动脉压明显下降,心率明显升高,血乳酸水平增高;体重明显下降;第3天为56.3%,第4-7天为37.5%;CLP组大鼠24h神经反射评分明显下降,并在第4天、第7天已逐渐恢复;新物体认知试验提示CLP大鼠学习记忆功能受损。在CLP后24h,NICD表达显著增加。Y-分泌酶抑制剂DAPT能降低CLP后NICD的表达,缓解认知功能损伤。 结论:CLP组大鼠完全模拟了脓毒症典型临床表现,神经反射评分及行为学检查提示大鼠脓毒症相关性脑病(SAE)模型制作成功;首次发现在CLP后24h,NICD表达显著增加,说明Notch信号通路可能参与了脓毒症导致的脑损伤;同时应用DAPT抑制Notch信号通路对脓毒症大鼠的记忆损伤有神经保护作用。 第二部分Notch信号通路参与脓毒症脑病的机制研究 目的:在本实验研究中,我们通过构建大鼠CLP脓毒症模型,主要探讨Notch信号通路参与脓毒症脑病的可能发病机制,以及γ-分泌酶抑制剂通过阻断Notch1信号通路对脓毒症脑病大鼠的干预作用。 方法:随机将59只SD大鼠分为4组,分别为假手术组(Sham)、假手术+DAPT组(Sham+DAPT)、CLP组(CLP)、CLP+DAPT组,在CLP或假手术后24h,将大鼠处死,取出海马组织用于Westen blot法检测PARP-1、Caspase-1; ELISA法检测TNF-α IL-1b\IL-6水平。TUNEL法观察神经元凋亡,HE染色法观察神经元死亡。 结果:我们研究表明在实验动物中,比较于假手术组和假手术+DAPT组,在CLP组TNF-α IL-lb、IL-6水平显著增高,尽管在CLP+DAPT组增高受到抑制。通过HE染色和TUNEL染色法检测,评估海马组织神经细胞死亡和凋亡。在假手术组和假手术+DAPT组中几乎不能找到HE阳性的细胞。在CLP手术后,海马组织CA1区域神经细胞死亡明显增加。然而,与CLP组相比,HE染色阳性细胞在CLP+DAPT组明显减少。此外,TUNEL法检测神经细胞凋亡情况,在CLP组中TUNEL阳性细胞明显增加,但是在假手术组几乎不能检测到TUNEL阳性细胞。而神经细胞凋亡数目在CLP+DAPT组明显多于假手术组—RAPT组,与CLP组比较,前两组凋亡数目明显减少。 在脓毒症大鼠中,海马组织炎症反应、神经元凋亡、神经元死亡明显增加。DAPT能明显减少海马组织神经元凋亡和死亡,及其TNF-α、IL-1b、IL-6、PARP-1和Caspase-1的表达。 结论:证实了Notch信号通路通过激活PARP-1降解,导致caspase依赖性神经元凋亡,Y-分泌酶抑制剂DAPT抑制海马神经元PARP-1降解,抑制caspase依赖性神经元凋亡。DAPT通过抑制CLP脓毒症大鼠海马组织神经元凋亡和炎症反应改善脓毒症脑病。 第三部分Notch信号通路调控脓毒症脑病的分子机制研究:调控NF-kB激活 目的:NF-kB是在核内参与炎症反应的关键转录因子,亦广泛存在于神经系统的细胞中,调控神经细胞炎症反应及凋亡。研究显示,NF-kB信号途径在脓毒症神经系统炎症中也扮有重要角色。本实验部分采用CLP模型,研究脓毒症对神经细胞NF-kB信号通路的影响,并通过Notch特异性抑制剂DAPT干预,观察其对NF-kB信号通路的影响,由此深入研究Notch对脓毒症脑病NF-kB信号通路的调控作用。 方法:取SD大鼠,随机分为四组(n=6),分别为假手术组(Sham)、假手术+DAPT组(Sham+DAPT)、CLP组(CLP)、CLP+DAPT组。手术操作前30分钟腹腔注射DAPT(10μmo/kg)或生理盐水(10mL/kg).术后每6小时皮下注射生理盐水(3m1/100g)及头孢曲松(30mg/kg)复苏,24小时处死大鼠,取大鼠海马组织,液氮保存待测。用western blot和EMUSA分组检测NF-K蛋白表达水平。 结果:在Sham组动物中,核因子NF-kB在胞浆中表达,CLP使得NF-kB胞浆向胞核内转移。与Sham组相比,CLP组胞核内NF-kB蛋白含量明显升高,以p65最为显著。与Sham及Sham+DAPT组相比,CLP组胞核内NF-kB蛋白含量明显升高,但DAPT处理降低胞核内p65、p50及Re1B蛋白表达水平。与Sham组相比,CLP组磷酸化IKK-β表达明显升高,但DAPT处理可抑制CLP时磷酸化IKK-β表达。同样,DAPT处理可抑制p65磷酸化,其可能与IKK-β活性降低有关,相应的必然会导致p65DNA结合活性降低。 结论:本研究中我们证实CLP导致的脓毒症引起NF-kB由海马神经细胞胞浆向胞核内迁移,应用Notch信号通路特异性抑制剂DAPT抑制Notch靶基因表达,抑制NF-kB向胞核内迁移及其DNA结合活性。结合前文,NF-kB依赖的转录激活引起脓毒症海马神经细胞炎症反应及细胞凋亡,可能是导致脑病发生的原因之一。抑制Notch信号通路可能成为治疗脓毒症脑病的有效方法。


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