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DAHP下调NOS通路和TP上调PI3K/Akt通路的抗炎抗凋亡作用对脑缺血的神经保护机制研究

孙雅谊  
【摘要】:第一部分DAHP下调MCAO模型中NOS通路的抗凋亡神经保护作用 目的:BH4,作为NOS的辅因子,参与调节NO的合成,且GTPCH-I为BH4体内从头合成的关键限速酶。本实验使用DAHP, GTPCH-1的抑制剂,通过来抑制BH4从头合成来下调NOS和NO的产生,进而研究DAHP对缺血性中风的神经保护机制。 方法:DAHP预保护12h,术后24h麻醉大鼠取脑,运用核磁共振成像(MRI)技术、TTC染色、TUNEL试验、免疫组化、免疫荧光、western blot和RT-PCR技术,检测抗凋亡关键蛋白和抗炎因子表达,以及评估损伤后脑梗死与水肿范围。 结果:作为BH4从头合成关键酶GTPCH-I的抑制剂,DAHP可有效下调MCAO/R后损伤区GTPCH-I,iNOS和nNOS的表达,但BH4不涉及损伤后早期eNOS合成。与MCAO损伤组相比,DAHP治疗能减少脑梗死和水肿范围的。TUNEL数据以及凋亡相关关键蛋白表达量,说明DAHP有抗凋亡的作用;同时,免疫组化和Western Blot数据均反映TP有下调NF-kB/COX-2/iNOS抗炎作用。 结论:本实验中,DAHP可以通过稀释iNOS和nNOS由MCAO/R损伤引起的表达上调,并可能通过下调NF-kB/COX-2/iNOS炎症相关通路,来实现其抗凋亡的神经保护作用。 第二部分TP通过PI3K/Akt介导体内外脑缺血缺氧再灌注模型的抗炎神经保护作用 目的:探讨雷公藤甲素(TP)对大鼠局灶性脑缺血再灌注模型和离体PC12细胞的在缺氧条件下的抗炎保护作用 方法:在体实验,30只SD大鼠分为三组:假手术组、MCAO损伤组、MCAO+TP治疗组。TP12h预保护,大鼠脑缺血1.5h再灌注24h后,利用MRI技术和TTC染色测定脑梗死的位置和范围,同时参照Longa神经功能评分法,进行行为学检测。另外,通过TUNEL试验、免疫组化、免疫荧光、Western Blot和RT-PCR技术进行指标检测。离体实验,通过MTT筛选合适的TP给药浓度范围;不同剂量TP预保护24h,PC12细胞缺氧2h,培养12h后检测炎症反应与凋亡坏死情况,研究TP在体外治疗的作用机制并筛选最优给药剂量。 结果:在体实验中,与MCAO损伤组相比:TTC染色显示,TP治疗能减少梗死范围;神经症状行为学评分显示,TP治疗可以减轻神经功能损伤;TUNEL实验显示,TP有抗凋亡的作用;同时,免疫组化与荧光、western blot和RT-PCR数据均反映TP的抗炎作用;检测PI3K/AKT通路关键蛋白表达pAkt/Akt,发现TP可明显上调MCAO/R损伤后Akt的磷酸化,起到促进存活抗凋亡的神经保护作用。离体实验中,TP治疗组有明显的抗炎抗凋亡坏死作用(与损伤组比较,P0.05)且综合分析0.4ng/ml可以作为日后体外研究的TP的给药剂量。 结论:雷公藤甲素预保护对大鼠MCAO模型有抗炎保护作用,且通过PI3K/AKT通路抗凋亡。同时,其对PC12细胞缺氧模型同样具有抗凋亡作用,且0.4ng/ml可作为有效给药剂量用于日后TP治疗相关研究。


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