收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

仔猪源高粘附性乳酸杆菌的分离鉴定、肠道定植及其粘附相关表面蛋白功能分析

章文明  
【摘要】:乳酸杆菌作为益生菌具广泛的益生效应,其在畜禽胃肠道中广泛存在,维持着机体胃肠道微生态的平衡,促进动物健康。在我国养殖业中,乳酸杆菌常被添加至饲料中,以促进动物生长,维持动物健康。特别是在仔猪饲养过程中,添加乳酸杆菌能有效预防仔猪腹泻,其使用价值备受重视。而细菌对肠壁的黏附和定植是其发挥益生效应的基础,因此益生菌的粘附机制粘附显得至关重要。本研究首先从仔猪肠道分离获得高粘附性的乳酸杆菌,侧重研究仔猪来源高粘附性乳酸杆菌的益生效应及其粘附机制,探索表面蛋白在乳酸杆菌粘附宿主过程中的重要作用,致力于解析自然粘附的乳酸杆菌表面蛋白的粘附共性,为乳酸杆菌的高效定植提供理伦指导,对筛选和培育仔猪高效乳酸杆菌等益生菌具有重要意义。 一、仔猪肠道高粘附性乳酸杆菌的分离鉴定及属性研究 1.乳酸杆菌的分离鉴定(试验一)。利用MRS选择性固体培养基从28日龄断奶杜长大仔猪的不同肠段(空肠和回肠)的食糜及粘液中分离纯化获得85株菌株,根据16S rDNA基因测序鉴定为:约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii, L. johnsonii)1株、唾液乳酸杆菌(L. salivarius)54株和罗伊氏乳酸杆菌(L. reuteri)30株,乳酸杆菌16S rDNA基因测序获得基因序列经提交GenBank后获得基因登录号,经过糖发酵鉴定后鉴定结果显示乳酸杆菌鉴定结果呈多样性,为不同的乳酸杆菌。获得的85株乳酸杆菌中36株来自空肠食糜、空肠粘液18株、回肠食糜3株和回肠粘液28株。 2.高粘附乳酸杆菌筛选(试验二)。从仔猪肠道获得高粘附性乳酸杆菌,为研究乳酸杆菌粘附机制及开发仔猪同源性应用菌株打下基础,本试验根据乳酸杆菌的显微镜检测及基因序列的进化树分析结果挑选出40株乳酸杆菌进行体外粘附性筛选,乳酸杆菌与Caco-2细胞系体外共培养后经革兰氏染色,在光学显微镜下观察乳酸杆菌的粘附数量。研究结果显示6株乳酸杆菌具较高粘附能力,显著高于其他细菌(P0.05),其中含唾液乳酸杆菌1株和罗伊氏乳酸杆菌5株。 3.高粘附乳酸杆菌的属性研究(试验三)。该试验研究了高粘附乳酸杆菌的耐酸和耐胆盐能力,同时观察其细菌自凝聚能力和其对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用。结果显示高粘附ZJ617和ZJ621菌株具良好的耐酸耐胆盐能力,与低粘附性乳酸杆菌相比,高粘附性菌株具良好的自凝聚作用,在6h时某些菌株自凝聚高达80%,远高于LGG商用菌株(28.5%)。通过竞争、排斥和驱除三个小试验研究几株高粘附能力菌株的抑菌效果,发现其能显著抑制大肠杆菌K88及沙门氏菌50335对Caco-2细胞的粘附(P0.05)。本试验进一步分析乳酸杆菌粘附性与其抑菌效果的相关性,发现乳酸杆菌粘附性高低与竞争性抑制大肠杆菌和沙门氏菌试验结果呈正相关,相关系数为0.68和0.50(P0.05),而在驱除方面无显著相关性,说明乳酸杆菌的早期定植能有效预防致病菌对宿主的侵害。 二、仔猪肠道高粘附性乳酸杆菌表面蛋白的功能分析 1.乳酸杆菌粘附表面蛋白的分离鉴定及结构解析(试验四)。乳酸杆菌在肠道内的粘附定植是其发挥益生效应的基础和前提,而乳酸杆菌表面的蛋白质及其他组分在其粘附过程中发挥重要作用。本研究致力研究乳酸杆菌表面蛋白质在其粘附过程中的作用。通过生物素标记Caco-2细胞和IPEC-J2细胞,并结合Western-blot杂交技术确认乳酸杆菌表面的粘附性蛋白。杂交结果显示罗伊氏乳酸杆菌(L. reuteri)存在着一种粘附性蛋白,该蛋白分子质量约为37kDa,经质谱鉴定为GAPDH蛋白,该蛋白和L. reuteri JCM1112(登录号YP_001841377)具有100%的同源性。软件分析结果显示该蛋白为亲水性蛋白,含跨膜区域,在GAPDH蛋白质的第149-164位氨基酸,氨基酸依次丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-苏氨酸-苏氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸。 2.乳酸杆菌粘附性表面蛋白在大肠杆菌中表达(试验五)。为验证GAPDH蛋白在乳酸杆菌粘附肠道及抑制致病菌过程中的作用并研究其在乳酸杆菌表面的定位,本试验通过体外大肠杆菌表达系统获得了该蛋白,通过抗His标签利用镍胶亲和层析法纯化目的蛋白并制备兔抗多克隆抗体。本试验成功获得纯度达96%的乳酸杆菌表面蛋白GAPDH,并成功制备获得抗体。经验证该抗体效价合格,且能有效检测到目的蛋白。 3.乳酸杆菌粘附性表面蛋白功能分析及其在细菌表面的定位(试验六)。研究发现将蛋白去除或用抗体封闭后其粘附性和抑菌能力显著下降(P0.05),说明该蛋白在L. reuteri粘附肠道上皮细胞及抑制致病菌粘附肠道上皮细胞的过程中发挥重要作用。免疫电镜及间接免疫荧光的研究结果显示GAPDH蛋白不仅在L. reuteri其胞质同时在其在表面的定位,揭示GAPDH蛋白存在罗伊氏乳酸杆菌菌表面。 三、商粘附性罗伊氏乳酸杆菌在小鼠及仔猪肠道内的定植分布及益生效应。 1.高粘附性罗伊乳酸杆菌在小鼠肠道内的动力学分布(试验七)。为验证高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在体外粘附试验结果,研究其在受试动物中应用的安全性及其在动物肠道内的分布与定植状态,本试验挑选80只6周龄健康雄性BALB/c进行体内试验,将小鼠根据体重平均分配成4组,即对照组、ZJ615乳酸杆菌组、ZJ617乳酸杆菌组和ZJ621乳酸杆菌组。为计算肠道上皮和排出的粪便中乳酸杆菌的定植数量,试验通过链霉素对乳酸杆菌菌株进行抗性筛选,获得抗链霉素菌株。试验全长为13天,持续灌胃3天后,于停止灌胃后的第1天、第3天、第6天和第10天每组引颈处死5只小鼠,检测小鼠肠道内空肠、回肠和结肠段内粘附定植及排出的粪便中乳酸杆菌的数量。结果显示罗伊氏乳酸杆菌对小鼠健康未造成影响,小鼠体态和饮食正常,意味分离获得的菌株安全,可进行饲喂试验。同时和对照组和低粘附性菌株相比,高粘附菌株L. reuteri ZJ617和ZJ621在小鼠回肠和结肠段大量定植,粪便中乳酸杆菌呈持续的排出状态,说明高粘附性罗伊氏乳酸杆菌菌株在小鼠肠道内具良好的定植能力。 2.高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在新生仔猪肠道内的定植状况及对其生长性能、仔猪肠道发育和免疫指标的影响(试验八)。为揭示高粘附性罗伊氏乳酸杆菌在新生仔猪肠道内的定植状态及对其生长性能等方面的益生作用。实验选取初生杜洛克仔猪50头,公母各半,根据体重和窝源基本一致的原则随机分成5组,每组10头,五组分别为对照组、低粘附性罗伊氏乳酸杆菌ZJ615、高粘附性乳酸杆菌ZJ617、乳酸杆菌ZJ621和阳性对照商用菌株鼠李糖乳酸杆菌LGG组。出生后的前2天为初乳期,仔猪出生第3天进行试验处理,正式灌胃为14天,饲喂剂量逐步增加,从103至109cfu,每两天增加一个数量级的菌,总计灌喂量2.22×109cfu,饲养期共25天,仔猪在21日龄时进行早期断奶。饲喂期间每天观察各组间仔猪腹泻情况,并在仔猪13、17、21、25日龄时收集肛门处粪便,计算每克粪便中乳酸杆菌的数量。仔猪在25日龄时进行称重,然后每组选择4头仔猪进行屠宰,取肠段固定,制作切片,染色,分析仔猪空肠和回肠绒毛高度、隐窝深度和肠绒毛上皮淋巴细胞的数量。取仔猪空肠、回肠和结肠涂板计算肠道上粘附的乳酸杆菌的数量。仔猪屠宰时收集血,析出血清分析IL-10和TNF-a细胞因子的表达量。试验结果显示饲喂高粘附性乳酸杆菌对仔猪日增重无影响,但能显著降低仔猪腹泻和提高仔猪空肠和回肠的绒毛高度,及绒毛上淋巴细胞的数量(P0.05),促进肠道的发育。仔猪肠段及粪便抗性涂板结果显示高粘附性乳酸杆菌在仔猪后肠段回肠和结肠能进行定植,仔猪断奶前粪便中的乳酸杆菌排出数量由高到低后趋于稳定状态,但断奶后排出数量显著降低。 综上所述,本试验从仔猪肠道分离获得高粘附性菌株,该菌株具良好的耐酸、耐胆盐等益生特性。高粘附性罗伊氏乳酸杆菌表面具粘附性蛋白GAPDH,其在细菌细胞质和表面均有分布和表达,且在乳酸杆菌粘附肠道细胞及抑制致病菌过程中发挥重要作用。体内试验发现高粘附性罗伊氏乳酸杆菌能在动物肠道内稳定定植,有效防止仔猪腹泻。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张贤群;J.P.Chappuis;;K88大肠杆菌的粘附性——中国和大白仔猪的比较[J];国外畜牧学.猪与禽;1986年03期
2 孙立广;孙烨;;蜂胶外用治疗疾病[J];中国蜂业;2008年07期
3 朱子浩;;防止粉体在料仓中结拱、堵塞方法的探讨[J];饲料工业;1984年01期
4 冯雪;;秋冬鸡群安全防病措施[J];家禽科学;2009年11期
5 冀献民;;芬兰灌肠的制作技术[J];中国农学通报;1991年04期
6 张建英;;糖和淀粉混合液用于生物防治效果好[J];河北农业科技;1991年03期
7 ;皮革消光补伤涂饰剂[J];中国乡镇企业信息;1994年04期
8 江定丰,李槿年,余为一;一株中华绒螯蟹病菌鉴定及其致病机理的研究[J];水利渔业;2003年06期
9 胡守奎,李槿年,余为一;蟹源致病性拟态弧菌的粘附及侵袭特性[J];水产学报;2004年05期
10 ;致富佳音[J];农民致富之友;2005年04期
11 许金东;李云波;赵思明;;籼米凝胶的压缩与剪切特性研究[J];中国农学通报;2007年05期
12 ;科技前沿[J];今日畜牧兽医;2011年03期
13 明如镜;Inger Edfors-Lilja;;肠道中有或无大肠杆菌K88受体的猪的性能[J];国外畜牧学.猪与禽;1987年03期
14 成茹;;以色列发明低胆固醇蛋加工法[J];饲料与畜牧;1993年01期
15 邱碧云;;洗衣粉也是一种好农药[J];农家之友;1998年08期
16 周彩杰;;带鸡喷雾消毒的注意事项[J];农民文摘;2007年03期
17 J、E、PEEIERS;徐仲钧;;断奶家兔中粘附埃希氏大肠杆菌的扫描电镜及透射电镜观察[J];浙江畜牧兽医;1985年S1期
18 徐振兴;;怎样选用润滑脂[J];河北农业科技;1986年12期
19 张武军;;防病新药——可杀得[J];今日种业;1992年05期
20 于晓坤;王立兵;徐闯;;鸡牡公路改性沥青混合料抗车辙能力的分析[J];东北林业大学学报;2006年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 周卫峰;原健安;戴经梁;;影响粘附性的沥青性质分析[A];天津市市政(公路)工程研究院院庆五十五周年论文选集(1950~2005)下册[C];2005年
2 田波;牛开民;夏玲玲;刘英;;西部地区地方性材料的路用性能评价[A];2004年道路工程学术交流会论文集[C];2004年
3 方圻;高长越;邓娟;陈曼娥;;丹参对急性脑缺血白细胞与内皮细胞粘附性变化的影响[A];第五次全国中西医结合神经科学术会议论文集[C];2004年
4 周卫峰;张秀丽;原健安;戴经梁;;基于沥青与集料界面粘附性的抗剥落剂的开发[A];天津市市政(公路)工程研究院院庆五十五周年论文选集(1950~2005)上册[C];2005年
5 孙辉;姜薇莉;田晓红;凌家煜;林家永;;利用物性测试仪分析小麦粉馒头品质[A];中国粮油学会第三届学术年会论文选集(下册)[C];2004年
6 李瑞欣;卢涛;张西正;闫玉仙;郭勇;郭春;宋梅;张燕;;壳聚糖/脱细胞真皮复合膜的制备及与HaCaT细胞的粘附性[A];2008年全国生物流变学与生物力学学术会议论文摘要集[C];2008年
7 杨敏;;从酒制膏的制作谈软膏基质——刘支柏老师经验整理[A];中华中医药学会第九届制剂学术研讨会论文汇编[C];2008年
8 何梅;刘永芳;黄贤惠;;烧伤创面铜绿假单胞菌细胞表面疏水性和粘附性的初步研究[A];全国烧伤早期处理专题研讨会论文集[C];2002年
9 黄莹;沈美庆;王军;贾莉伟;;铈锆固溶体的添加量对氧化铝涂层性能的影响[A];中国化工学会2005年石油化工学术年会论文集[C];2005年
10 姜伟;王冬;关绍巍;姜振华;;含氟聚酰亚胺材料的合成[A];2005年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郝一文;血管内皮细胞蛋白激酶C与锚蛋白、CD44分子生物学特性之间关系的研究[D];中国医科大学;2005年
2 曲莉;6A8α-甘露糖苷酶表达对Jurkat细胞粘附性的影响[D];中国协和医科大学;2006年
3 葛亚坤;内皮氧化损伤体外分析系统的建立及在药效评价中的应用[D];浙江大学;2009年
4 章文明;仔猪源高粘附性乳酸杆菌的分离鉴定、肠道定植及其粘附相关表面蛋白功能分析[D];浙江大学;2014年
5 侯幼红;药物和化学试剂对致病酵母细胞表面疏水性和粘附性的影响[D];中国协和医科大学;1994年
6 闫凤英;造血调控因子HAPO、PF4对造血干细胞调节的体内外研究[D];中国协和医科大学;2005年
7 王学菊;CpG ODN对疫苗的增效作用及对病毒致病性和肿瘤生长的影响[D];吉林大学;2008年
8 吴福国;表达Cdc42-shRNA重组慢病毒载体的构建及其对膀胱癌细胞影响的实验研究[D];兰州大学;2007年
9 贺红卫;非粘附性液体栓塞材料治疗脑动脉瘤和脑动静脉畸形的研究[D];山东大学;2006年
10 唐均英;不同CO_2压力状态对卵巢癌SKOV_3细胞增殖、侵袭力影响的实验研究[D];重庆医科大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 任玉娜;聚合物改性沥青粘聚性与粘附性研究[D];中国石油大学;2011年
2 封晨辉;沥青材料的粘度与粘附性研究[D];长安大学;2003年
3 张亚红;壳聚糖—巯基醋酸偶合物粘附制剂研究[D];重庆医科大学;2007年
4 潘伟好;具有粘附性双歧杆菌的筛选及相关特性研究[D];中国农业大学;2005年
5 孙宇;甲氨蝶呤微球的制备及其经鼻给药系统的研究[D];沈阳药科大学;2008年
6 蔡婷;沥青材料的组分与粘度试验分析[D];长安大学;2005年
7 杨亚兰;依托泊苷鼻用壳聚糖微球的研制[D];河北医科大学;2006年
8 王雪元;关于用花岗岩作SMA骨料的技术研究[D];大连海事大学;2008年
9 钱晓鸥;青海地区酸性石料与沥青粘附性改善技术的研究[D];长安大学;2007年
10 刘雪威;鸡致病性大肠杆菌FimC基因缺失菌株的构建及其生物学特性的研究[D];东北农业大学;2008年
中国重要报纸全文数据库 前7条
1 嵇旭东;腹泻种种探病因[N];江苏经济报;2000年
2 张锦星;高血糖危害大[N];大众卫生报;2000年
3 庄愉;眼部嵌入剂的研究[N];中国医药报;2004年
4 浙江省农业科学院 许尧兴;饲用微生态制剂应用中亟待注意的问题[N];中国畜牧报;2005年
5 王东兴;高永良;鼻腔给药新剂型研究进展[N];中国医药报;2002年
6 哈真 王桂清;南充炼化总厂开发出重交沥青新产品[N];中国石油报;2004年
7 韩寿昌;我市研发一种新型沥青[N];邯郸日报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978