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虎杖中白藜芦醇、虎杖苷的体外代谢及大鼠体内药代动力学研究

叶肖栗  
【摘要】:虎杖中的主要活性成分为虎杖苷及其苷元白藜芦醇,两者均具有保护心肌细胞、改善微循环、抑制血小板聚集、抗内毒素休克、降血脂、抗氧化等多种药理作用。但是目前两者在体内的药代动力学过程尚不完全清楚。 目的:本研究拟分别利用HPLC和HPLC-MS(?),对虎杖提取物和生物样品中白藜芦醇和虎杖苷进行定量分析,对单体化合物白藜芦醇和虎杖苷以及虎杖提取物进行大鼠体内的药动学评价,并应用体外代谢实验了解白藜芦醇和虎杖苷之间的转化规律与体内研究对照分析,为临床合理用药提供依据。 方法:本研究用70%乙醇溶液提取虎杖饮片,得到虎杖提取物,冷冻干燥后保存。采用HPLC对虎杖提取物中的白藜芦醇和虎杖苷进行含量测定。HPLC色谱条件为:Shimadzu LC-2010AHT液相色谱系统,色谱柱为Shimadzu VP-ODS C18分析柱(250×4.6mm ID5μm);保护柱为VP-ODS C18柱(10×4.6mm ID5μm);柱温30℃;流动相为A:0.1%甲酸水溶液,B:乙腈,梯度洗脱;洗脱程序为0minB相5%,15minB相20%,28min B相100%,30min B相100%;流速为1.0ml/min;进样量为10μL;双通道检测,通道1检测波长为307nm,用于测定白藜芦醇;通道2检测波长为290nm,用于测定虎杖苷。 在体外试验中,考察虎杖苷在肝匀浆和肠道菌群中的代谢过程。将大鼠肝脏和含糖PBS以1:9(w:v)的比例制备得肝匀浆液;用新鲜大鼠粪便以1:4(w:v)的比例加入生理盐水,匀浆后提取菌群,加入培养基孵育制成肠道菌液。取虎杖苷分别在肝匀浆和肠道菌液中于37℃孵育。用HPLC法测定孵育体系中的白藜芦醇和虎杖苷含量,并以肝脏CYP450酶的特异性底物硝苯地平作为阳性对照药,用来评价本实验中肝匀浆的代谢活性。 在大鼠体内试验中,考察虎杖提取物、白藜芦醇+虎杖苷混合物、白藜芦醇和虎杖苷在大鼠体内的药代动力学。本实验中为测定大鼠体内的血药浓度,建立了更为灵敏的HPLC-MS法。采用LC-20A-LCMS-2010EV液相色谱-质谱联用系统,利用Shim-pack VP-ODS C18分析柱(250x4.6mm,5pm)分离,SPD-M20A二极管阵列检测器,电喷雾(ESI)离子源和四级杆质量分析器(Shimadzu Corp. Kyoto, Japan).色谱条件:柱温设定为30℃;线性梯度洗脱:A相为0.05%甲酸水溶液,B相为乙腈,起始时B相20%,5分钟后B相100%,维持10分钟;流速为1.0ml/min,通过分流器将0.2ml/min的流出液注入离子源。质谱条件:选择离子监测(SIM)检测:白藜芦醇m/z229,虎杖苷m/z391,内标染料木素m/z271。染料木素作为内标物。分别制备四种灌胃液:虎杖提取物灌胃液、白藜芦醇灌胃液、虎杖苷灌胃液、白藜芦醇+虎杖苷混合灌胃液,对大鼠灌胃给药,进行体内药动学研究。灌胃容积均为10.0ml/kg.使用药动学软件3P97对测得的数据进行拟合分析。 结果:用HPLC法测定虎杖提取物中的白藜芦醇和虎杖苷,白藜芦醇和虎杖苷的保留时间分别为16.78min和13.68min,相应峰位没有干扰。白藜芦醇的线性范围为1.80-180μg/ml (R2=0.9999),虎杖苷在3.50-350μg/ml (R2=0.9999),线性关系良好。白藜芦醇的定量限为0.18μg/ml,检测限为0.10μg/ml,虎杖苷的定量限为0.35μg/ml,检测限为0.15μg/ml。对三个浓度水平的白藜芦醇和虎杖苷对照品溶液进行测定,得日内精密度和日间精密度的RSD均小于2%。测得回收率的RSD值均小于2%。测定三个批次的虎杖提取物冻干粉,得到白藜芦醇的含量为17.8、16.5、18.3mg/g,虎杖苷的含量为72.1.73.7、69.6mg/g,两者含量比例约为1:4。根据该结果配制得四种灌胃液,使白藜芦醇的含量约为10mg/ml,虎杖苷的含量约为40mg/ml。 在体外代谢实验中,虎杖苷与大鼠肝匀浆共孵育,分别于0、15、30、45、60、120、240分钟取样,与肠道菌液孵育分别于0、120、240、480、960、1440分钟取样测定白藜芦醇和虎杖苷的含量。结果显示,虎杖苷的含量逐步减少,而苷元-白藜芦醇的含量逐渐升高,这提示虎杖苷在肠道菌群和肝脏代谢酶的作用下可脱糖转化为苷元-白藜芦醇。 在药动学研究中,给大鼠分别灌胃白藜芦醇、虎杖苷、白藜芦醇+虎杖苷混合物和虎杖提取物后,用HPLC-MS法测定白藜芦醇和虎杖苷在血浆中的含量。白藜芦醇的线性范围为0.0018-3.6μg/ml (R2=0.9986),虎杖苷为0.0035-7.0μg/ml (R2=0.9988).白藜芦醇的定量下限为0.0018μg/ml,检测限为0.0008μg/ml,虎杖苷的定量下限为0.0035μg/ml,检测限为0.0015μg/ml.对三个浓度水平的对照品血浆样品进行分析,得日内精密度的RSD均小于5.5%,日间精密度的RSD均小于6.1%,表明日内、日间精密度良好。通过对三个浓度水平的对照品血浆样品的冻融稳定性试验,包括3个短冻融周期,每个周期24小时,和1个20天冻融周期,得到的RSD值均小于7%,表明-20℃的环境短期保存对血浆中的白藜芦醇和虎杖苷成分基本无影响。 白藜芦醇和虎杖苷的血药浓度-时间数据使用药动学软件3P97进行拟合,结果表明白藜芦醇和虎杖苷在大鼠体内的药动学过程与二室开放模型的拟合程度相对较高。对所得的药动学参数进行分析可得:各组药动学参数中时滞时间(Lag time)、峰浓度Cmax)和达峰时间(Tpeak)的变化没有统计学差异(P0.05)。 比较三组之间的虎杖苷药动学参数可以发现:与单独灌胃相比,提取物和混合物组的AUC、CL值均无显著性差异;T1/2α、T1/2β均增大,相互之间也有显著性差异,表明其体内停留时间延长。提取物组与混合物组之间Ka (0.14vs0.07, P0.05)、T1/2Ka (4.83vs10.34)有显著性差异,而提取物组和单独灌胃组相比Ka、T1/2Ka无显著性差异,提示虎杖苷的代谢过程可能主要受白藜芦醇的影响,而影响吸收过程的因素则更多地来自虎杖提取物中的其它成分。 比较三组之间的白藜芦醇药动学参数可以发现:与单独灌胃相比,提取物和混合物组的AUC (187.56.178.35vs98.18, P0.05)、CL(0.54、0.56vs1.02, P 0.05)均有显著性差异,Vd无显著性差异,半衰期均显著增大。提取物组与混合物组之间AUC、CL、Vd、Ka等值无显著性差异,但是T1/2。和p有显著性差异。上述结果提示白藜芦醇在大鼠体内的药动学过程主要受到虎杖苷代谢产生的白藜芦醇的影响,虎杖提取物中的某些成分可能影响白藜芦醇的分布和代谢过程。 结论:体外代谢实验证实虎杖苷可在肝药酶、肠道菌群的作用下被迅速代谢为其苷元-白藜芦醇。体内药动学研究发现白藜芦醇的体内代谢动力学过程受到了虎杖提取物中某些成分的影响,可能与虎杖苷被部分代谢为白藜芦醇有关。推测虎杖苷在体内部分转变为白藜芦醇,从而使得白藜芦醇在体内AUC增加,作用时间延长。临床用药需注意因体内代谢导致有效成分剂量变化而产生的影响。


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