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茶园土壤抗生素抗性细菌及抗性基因研究

徐晨光  
【摘要】:本文选择不同利用类型土壤作为研究材料,以土壤抗生素抗性细菌及抗性基因研究为目的,较系统地研究了不同土壤利用类型对外源抗生素的响应,土壤耐受菌的形态以其抗性基因存在分布等,取得了许多有意义的研究结果,主要结果如下: 1.采用室内恒温培养,向茶园土壤中分别添加青霉素和四环素,研究了外源抗生素对茶园土壤微生物群落结构的影响。结果表明,外源青霉素对茶园土壤细菌、放线菌和真菌均有一定的抑制作用,当青霉素质量分数为100mg/kg时,培养3周后,与对照(CK)相比,细菌、真菌和放线菌的数量分别减少了80%、50%和50%。四环素在低质量分数下即可显著抑制茶园土壤中细菌和放线菌的生长,但对真菌没有明显的抑制作用。磷脂脂肪酸法(Phospholipid fatty acid,PLFA)的结果表明,不同质量分数的青霉素和四环素处理茶园土壤中微生物群落结构发生明显变化。青霉素或四环素处理后G-/G+值都升高,四环素处理后磷脂脂肪酸20:0的含量最丰富,表明磷脂脂肪酸20:0表征的微生物可能是茶园土壤产生四环素耐性菌的主要类群。 2.采用培养试验研究了多种类型(四类八种)抗生素对土壤微生物量和有效态氮的影响。结果表明,4类8种抗生素中除了阿奇霉素在低浓度时对微生物量碳(MBC)有明显的抑制作用外,其它7种抗生素都表现出对MBC的促进作用;氨基糖苷类和p-内酰胺类抗生素处理增加了土壤中微生物量氮(MBN)的含量,但大环内酯类和四环素类抗生素均降低了MBN,但是随着培养时间的增加,微生物量氮含量逐渐恢复。说明当抗生素浓度为1mg/kg时,土壤微生物能利用大部分抗生素中的碳和氮。而当抗生素浓度很高时,土壤微生物有些被杀死,有些却能产生抗性。随着培养的进行,四环素类抗生素处理的土壤中硝态氮含量增加,当培养至7d,50mg/kg金霉素和土霉素处理的土壤硝态氮含量分别比对照高50%和45.4%;而其它3类6种抗生素处理后土壤硝态氮的含量明显下降,且抗生素浓度越高硝态氮下降越明显。与硝态氮含量相反,除了四环素类抗生素红霉素和土霉素处理降低了土壤中氨态氮的含量,其他六种抗生素均能增加土壤氨氮含量,随着培养时间的增加,氨态氮含量又慢慢恢复至对照水平。说明抗生素的污染将影响土壤中氨态氮和硝态氮之间的转化,且不同类型的抗生素影响效果不同,但大多抗生素表现为抑制氨态氮向硝态氮的转化,说明氨氧化细菌和氨氧化古菌有可能受抗生素污染的胁迫作用,有待进一步研究。3.以抗生素为单一碳源抗生素抗性菌的分离,本实验共分离出生长良好、菌落特征不同的菌株5株,均为革兰氏阴性菌。生长曲线分析表明抗生素能刺激菌株生长并且溶液中抗生素浓度明显降低。分子生物学鉴定结果表明,五种菌株分别属于溶杆菌属(Lysobacter)、贪噬菌属(Variovorax)、假单胞菌属(Pseudomona)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),表明以抗生素为单一碳源的菌株系统发育地位具有多样性。 4.对分离得到的5株耐受菌进行了多重耐药性及其耐药机理分析,结果表明5株耐受菌均具有多重耐药性,但菌株耐药性受抗生素浓度的影响。质粒消除后,耐药性发生了明显变化,68%的耐药性消失,说明大部分的抗性基因位于质粒中。进一步通过PCR的方法,对常见的8种抗生素抗性基因和2种代表性整合酶基因(inT1,inT2)的存在进行了分析,结果表明5株耐受菌均检测到了blapsE-1基因,且4株菌株检测到了tet(C)基因,这些抗性基因的存在使得这些菌株表现了强耐受性。但5种菌株中没有检测到1类和2类整合子,这大大降低了抗性基因的传播风险。实验中虽然检测到了青霉素和四环素的抗性基因,但这并不足以推测以抗生素为单一碳源抗性菌株的耐药机理,有待于进一步开展深入的研究。


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