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基于SAQPCR的转基因拷贝数鉴定及基于转基因的MrMYB1功能分析

黄玉吉  
【摘要】:第一部分:建立标准添加法用于转基因拷贝数鉴定。实时定量PCR已被用于转基因的拷贝数鉴定。然而,过去传统的实时定量PCR由于无法对PCR效率实现准确估计导致实验结果的偏差。本研究,建立了一新的方案——标准添加实时PCR法(Standard Addition Quantitative real-time PCR),简称SAQPCR用于准确鉴定转基因拷贝数。其原理是通过在待测样品DNA中添加已知量的目的基因片段来改变Ct,根据Ct与添加量的变化相关关系,计算待测样品中已有目的基因量与添加量的百分比,而无需对PCR效率进行估计,从而实现对目的基因的准确绝对定量。首先,构建一既携带有内标基因又携带外源目的基因的重组质粒用作标准DNA。然后,确定标准DNA适合的添加量而使其不影响PCR效率,以及在数据分析中选择合适的循环数。本研究采用SAQPCR法分析了6株转基因T0代Ailsa Craig (AC)番茄(Solamum lycopersicum Mill.),并用Southern杂交验证进行验证。SAQPCR法可在多种植物和多种基因上准确鉴定转基因拷贝数而只需要少量的植物材料。同时,还可以利用该方法进行转基因植物的纯合性分析。 第二部分,对来自于杨梅(Myrica rubra Sieb. and Zucc.)上与花青苷合成相关联的R2R3MYB转录因子MrMYB1进行转基因功能分析。以花椰菜花叶病毒35S为启动子成功实现了对拟南芥、烟草和番茄的转化。过量表达MrMYB1可使拟南芥的根、茎、叶及种子变红;可促进烟草生殖器官组织花青苷累积但叶片却不变红;可使番茄的花药和种子出现不同程度的花青苷累积。基因表达分析结果显示,在过量表达MrMYB1的拟南芥植株中AtCHS(chalcone synthase,查儿酮合成酶)、AtDFR(Dihydroflavonol-4-reductase,二羟黄酮醇还原酶);AtANS (anthocyanidin synthase,花青苷合成酶)及bHLH转录因子AtTT8(TRANSPARENT TESTA8)被显著上调。在MrMYB1过量表达的烟草花瓣、子房及幼嫩种子中,花青苷合成基因及bHLH转录因子(NtAn1a, NtAn1b)都被上调,但在转基因烟草叶片中,MrMYB1的过量表达却无法诱导其花青苷的合成。与花瓣和幼嫩种子相比,叶片中的NtAn1a, NtAn1b转录水平很低且无法被MrMYB1刺激增强。在过量表达MrMYB1番茄植株的叶片、花药、果实和种子的花青苷合成基因的转录水平基本上都很低,只有SIDFR基因的转录水平在4个组织中均被上调,其余基因变化不明显;在番茄上,MrMYB1也促进了其内源bHLH的表达,但转录水平很低,唯有种子的bHLH表达稍高些。这些结果显示了内源bHLH的高表达,无论是其本质上增强或是被外源转化基因的刺激增强表达,对于植物组织花青苷的累积是必需的。


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