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中国番茄黄曲叶病毒卫星编码的βC1蛋白与烟草寄主因子NtRFP1的互作研究

包敏  
【摘要】:中国番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)是典型的单组份双生病毒,其伴随的卫星DNA (TYLCCNB)是该病毒在寄主植物上引起症状所必需的。研究发现,TYLCCNB的互补链上所编码pC1蛋白是一个症状决定因子和RNA沉默抑制子。 为深入了解TYLCCNV/TYLCCNB在寄主植物上的致病机理以及植物在抵抗病毒侵染过程中所产生的防御反应。本研究对TYLCCNB βC1与普通烟寄主因子RING finger蛋白NtRFP1的互作展开了研究。酵母双杂交和双分子荧光互补试验发现, TYLCCNB βC1能与NtRFP1发生互作。序列分析表明,普通烟NtRFP1基因全长为1455bp,预测编码一个485aa的蛋白。另外,利用DNAStar软件对普通烟NtRFP1蛋白进行聚类分析发现,其与辣椒CaRFP1和番茄S1RFP1等都具有很高的同源性,分别达到86.4%和83.4%。进一步通过InterProScan软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)对NtRFP1蛋白的保守功能域进行了分析,结果表明NtRFP1蛋白主要含有VWA (von Willebrand factor (vWF) type A domain)和RING (RING finger domain)两个保守的功能结构域。根据NtRFP1的二级结构与保守功能域分别设计了4个NtRFP1突变体用于分析其与βC1蛋白互作的区域,结果表明NtRFP1蛋白的RING结构域(第443-475位氨基酸)是与pCl蛋白互作的位点。 通过real-time RT-PCR测定NtRFP1mRNA在普通烟中表达的组织特异性,结果表明NtRFP1mRNA在种子中表达量最高,其次是在根和花中,而在叶子和茎中表达量最低。另外,TYLCCNV/TYLCCNB的侵染能上调NtRFP1mRNA在普通烟叶片中的积累。通过亚细胞定位分析发现NtRFPl蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞质与细胞核中。 为深入研究NtRFP1与βC1体内互作的生物学意义,我们采用农杆菌介导的方法对普通烟进行遗传转化,获得具有卡那霉素抗性的T0代普通烟植株,通过PCR筛选阳性转基因植株,并利用real-time RT-PCR方法检测转基因植株中NtRFP mRNA在细胞内的积累水平,获得过表达NtRFP1基因[NtRFP1(+)]或沉默NtRFP1基因[NtRFP1(-)]的转基因普通烟植株。为研究NtRFP1蛋白对病毒诱导的症状以及植物体内病毒DNA积累量的影响,对T1代具有卡那霉素抗性的NtRFP1(+)、NtRFP1(-)及野生型(WT)普通烟注射接种TYLCCNV/TYLCCNB并观察症状。结果表明,与WT普通烟相比,NtRFP1(+)植株表现出轻微的症状,但病毒DNA积累量高;而NtRFP1(-)植株症状表型严重,但病毒DNA积累量低。表明NtRFP1蛋白能减轻病毒诱导的症状并负调控植物对病毒的积累。 利用PVX载体(pGR106)构建了GFP、NtRFP1以及NtRFP1E3ligase-dead突变体NtRFP1H459Y的重组表达载体,并分别与pGR106-βC1浸润共接种本氏烟。共表达βC1与NtRFP1蛋白的植株表现出轻微的症状,而共表达βC1和GFP或NtRFP1H459Y蛋白的植株症状表型严重。通过免疫印迹分析,共表达NtRFP1样品中的βC1蛋白含量明显比对照组共表达GFP样品中βC1蛋白含量少,几乎检测不到βC1蛋白;而共表达NtRFP1H459Y样品中βC1蛋白的含量与对照组没有明显的变化。 上述结果表明,普通烟NtRFP1蛋白能促进βC1蛋白的降解,进而减轻βC1蛋白所诱导的症状,从而有利于实现对病毒的防卫反应。


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