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核桃内生细菌发酵棉秆水解糖液产油及其代谢基础分析

张琴  
【摘要】:以廉价木质纤维素原料为基质生产的微生物油脂用于第三代生物柴油的生产已引起了全世界的广泛关注。从产油植物分离的内生菌可能具有积累与宿主植物类似的油脂的潜能。然而,从产油植物分离的产油内生细菌及其利用木质纤维素水解液生产油脂的研究尚未见报道。从含油量较高的新疆薄皮核桃果实内生环境分离获得了一株产油内生细菌HB1310,经16S rDNA序列分子生物学和生理生化特征分析,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株能够有效利用棉秆水解糖液积累胞内油脂。优化的分批发酵条件分别确定为C/N比50/1、发酵温度30℃、发酵起始pH值6.5,该条件下菌株油脂含量可达菌体干重的30%以上。在此基础上对其分批发酵产油过程进行了动力学分析和拟合,构建了拟合较好的动力学模型。为深入研究菌株HB1310发酵产油的细胞学基础,本研究还通过对不同发酵时期的菌株细胞进行尼罗红荧光染色和透射电镜观察,阐明了该菌株在不同发酵时间积累胞内油脂的潜能。对菌株所产油脂脂肪酸组分的分析表明其脂肪酸的主要成分是肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸,其估算的十六烷值为61.8,证明该菌株所产脂肪酸较适合用于生物柴油的生产。对核桃内生细菌HB1310分批发酵棉秆水解糖液产油的过程进行了分段控温、调控pH值和补料调控。结果表明,分段控温方式对全发酵过程中菌体的生物量、葡萄糖和木糖利用率的提高均有显著的促进作用,使得菌株的油脂含量在发酵前期低于对照,在发酵后期有一定幅度提高,其增幅可达8%~13%。pH调控处理对菌体胞内油脂积累的改善作用较小,仅在pH7.0下培养24h的处理能在发酵后期(发酵48 h后)对细菌油脂的积累起到一定改善作用。补料发酵是一种有效促进核桃内生细菌积累胞内油脂的发酵方式,本研究中采用的三种补料方式均实现了核桃内生细菌生物量的小幅增加和菌株油脂含量的大幅度提高,其油脂含量增长幅度达18%~24%。对核桃内生细菌HB1310的基因组进行了测序,结果显示,该细菌的基因组为一条长4.1 Mb的染色体,GC含量为43.5%。该基因组共预测到4314个CDSs,其中3351(77.7%)个CDSs编码的产物具有明确的功能。基于KEGG数据库比对的代谢途径,详细分析了糖酵解途径、磷酸戊糖途径和脂肪酸合成途径,初步阐明了该菌株发酵棉秆水解糖液时木糖进入磷酸戊糖途径进行代谢的途径,并指出其脂肪酸合成酶FAS关键基因可能关联了菌株中大部分饱和及不饱和脂肪酸的合成。基于基因组注释的KEGG代谢途径和菌株产油、基质利用特性,对拟存在的代谢途径中的关键节点代谢物进行了通量计算和代谢流的分析。在磷酸戊糖途径中引入了从木糖到木酮糖这一反应,为菌株对棉秆水解糖液中葡萄糖和木糖的利用给出了合理的分析。同时分析了菌株HB1310脂肪酸合成的关键酶及与油脂合成的关系,结果表明,脂肪酸合成酶(FAS)活性与菌株油脂产量呈高的正相关关系,说明脂肪酸合成酶对该菌株的油脂合成起正调控作用。本研究还基于稳定期(48 h)的代谢途径构建了代谢网络,通过全代谢途径通量分析表明,此时菌株代谢网络中的碳架主要流向了脂肪酸的合成。6-磷酸-葡萄糖节点的NADPH合成途径主要为该时期菌株脂肪酸的合成提供了还原力NADPH。本研究筛选获得一株能够发酵棉秆水解糖液产油的核桃内生细菌HB1310,通过对发酵过程的调控,实现了该菌株胞内油脂的优化生产;并对该细菌产油的细胞学基础以及全基因组数据进行了分析,构建了菌株发酵产油的代谢网络,为深入研究该核桃内生细菌的脂肪酸生物合成机制、实现其发酵产油过程的有效调控奠定了理论基础。


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