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白菜不同雄性不育株的观察与核不育两用系的重测序分析

高明慧  
【摘要】:雄性不育是被子植物普遍存在的一种自然现象。发现雄性不育植株是选育雄性不育系的基础,因此植物雄性不育植株得到育种学家的广泛重视,也是科研人员进行科学研究的重要材料。目前,人们已从形态学、细胞学、生理生化、遗传学、分子生物学等多方面对植物雄性不育进行了深入的研究。本文以白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino, syn. B. rapa ssp. chinensis)'矮脚黄’核不育('Aijiaohuang' genic male sterility, ajhGMS)两用系'Bcajh97-01A/B’和本实验室新发现的几个雄性不育株‘Bc123-26’和‘Bc123-27’,以及‘Bc123-75’中的雄性不育株为实验材料,利用形态学、细胞学和超微结构观察发现花粉败育的时期,针对其中的一个实验材料‘'cajh97-01A/B'两用系进行全基因组重测序,分析所得序列和数据,以期达到寻找花粉败育突变发生位点的目的。取得的主要结果和结论如下:(1)通过植株形态学观察表明,新发现的几个雄性不育株与可育株形态学表现出一定差异。‘Bc123-26’与‘Bc123-27’开花后期在萼片长度、花瓣长度、长花药长度、短花药长度、长花丝长度、短花丝长度和雌蕊长度等都与各自可育株相比较都存在不显著差异。'Bc123-75'不育株与可育株花器官长度也存在不显著差异。‘Bc123-26’和‘Bc123-27’开花早期花药出现粘连现象,'Bc123-75'不育株的花瓣较可育株皱褶。(2)通过花粉形态学和不同发育时期的细胞学观察,表明几个雄性不育株与可育株花粉形态学和细胞学表现存在差异。扫描电镜观察发现‘Bc123-26’与‘Bc123-27’在开花早期花粉粒均出现畸形现象,‘Bc123-27’比例明显大于‘Bc123-26’,比例分别为36.9%和63.5%;开花后期不育株花粉粒也出现畸形现象,但畸形率均降低,分别为34.2%和27.3%;花粉粒亚历山大染色结果表明‘Bc123-26’和‘Bc123-27’开花早期花粉活力无显著差异,后期也无显著差异;DAPI染色结果表明开花后期‘Bc123-26’和‘Bc123-27’花粉细胞核均正常;苯胺蓝染色结果表明开花后期‘Bc123-26’花粉粒上存在胼胝质;半薄切片观察‘Bc123-26’和‘Bc123-27’,发现花粉粒发育在开花前期和开花后期均出现异常。‘Bc123-75’可育株和不育株扫描电镜观察发现不育株花粉粒畸形率明显高于可育株;花粉粒亚历山大染色结果表明‘Bc123-75’可育株花粉活力高于不育株;DAPI染色结果表明花粉细胞核畸形率‘Bc123-75’不育株高于可育株;苯胺蓝染色结果表明‘Bc123-75’不育株成熟花粉粒表面有胼胝质的存在;半薄切片观察发现‘Bc123-75’不育株花粉在发育单核期开始出现异常。扫描电镜观察发现'Bcajh97-01A’较'Bcajh97-01B'的花粉畸形率高达100%,主要表现为花粉粒圆形,而且多个粘连在一起,亚历山大染色结果也证明'Bcajh97-01A'花粉无活力。(3)透射电镜观察'Bcajh97-01A'花粉发育,结果表明花粉发育异常。在单核早期小孢子已明显异常,染色极深,以至于看不到细胞器,没有花粉外壁,只有一层肼胝质包围,之后的时期也未形成外壁,外围只有一圈颗粒物体包围,细胞器开始很少后完全消失。花粉最终大部分降解,剩余少数黏连在一起。(4)通过对'Bcajh97-01A'口'Bcajh97-01B'全基因组重测序,得到若干SNP和Indel位点。并对这些位点分析确定在染色体上的位置是基因间、外显子还是内含子,并对在外显子上的位点深入分析确定是否为非同义突变,最终确定有90个基因含有非同义突变差异位点。(5)90个差异基因同源克隆及测序。利用primer premier5.0设计引物,同源克隆得到产物测序,测得基因序列并不与全基因组重测序结果完全吻合。


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