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耐碳青霉烯革兰阴性杆菌分子流行病学及MALDI-TOF MS在碳青霉烯耐药决定子快速检测中的应用研究

胡燕燕  
【摘要】:大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌是临床分离率占前四位的革兰阴性杆菌。碳青霉烯类抗生素耐药革兰阴性杆菌的出现和流行,给临床抗感染治疗和医院内感染控制带来了极大困难。基于分子分型技术的分子流行病学研究可明确菌株的流行情况和变化趋势,为感染防控措施的制定提供科学依据;革兰阴性菌碳青霉烯类耐药决定子的快速检测可为临床感染性疾病的诊治争取宝贵时间。 本研究首先对近年来我院出现的碳青霉烯类耐药的重要革兰阴性杆菌的流行情况、耐药机制及历年来的变迁进行调查。受试菌株包括2009年-2012年浙江大学医学院附属第二医院分离的碳青霉烯类耐药或敏感性降低的16株大肠埃希菌、87株肺炎克雷伯菌、80株鲍曼不动杆菌和67株铜绿假单胞菌。药物敏感性试验显示多黏菌素B和黏菌素对碳青霉烯类耐药菌株具有强大的抗菌活性,其次为阿米卡星。产碳青霉烯酶是革兰阴性杆菌对碳青霉烯类耐药的主要原因。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌所产碳青霉烯酶以KPC-2为主,鲍曼不动杆菌主要产OXA-23型碳青霉烯酶。对碳青霉烯类耐药菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析发现肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的医院内克隆传播较为严重。肺炎克雷伯菌从2009年到2012年期间,一直存在KP-A型优势克隆株纵向传播现象;铜绿假单胞菌的克隆传播现象不明显,但自2010年以来,PA-A型克隆株一直在我院传播。鲍曼不动杆菌各年份内横向传播现象较严重,而各年份之间没有同一优势克隆株。多位点序列分型(MLST)显示,ST131和ST11分别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌主要的ST型;铜绿假单胞菌以ST463最为常见;鲍曼不动杆菌的ST型分布较为分散,但几个主要的ST型均属于克隆复合群208(CC208)。除了产碳青霉烯酶,高产ESBLs或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失是导致肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药的另一主要原因。 以上述结果为基础,本研究采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术建立了可快速、准确地检测革兰阴性杆菌碳青霉烯耐药决定子的方法。用MALDI-TOF MS对50株革兰阴性杆菌进行碳青霉烯酶检测,整个过程仅需2小时左右,且操作简便,试剂成本非常低,适合大样本量检测。提取10株大肠埃希菌和8株肺炎克雷伯菌的外膜蛋白用MALDI-TOF MS检测,肺炎克雷伯菌主要缺失质荷比为37,000和38,000的质谱峰,大肠埃希菌同样主要缺失这两个质谱峰。与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相比,大肠埃希菌外膜蛋白MALDI-TOF MS缺失的37,000-和38,000-m/z的质谱峰分别对应SDS-PAGE的40kDa和41kDa条带;肺炎克雷伯菌外膜蛋白MALDI-TOF MS缺失的38,000-m/z的质谱峰对应SDS-PAGE的42kDa条带,37kDa的质谱峰在SDS-PAGE上未显示;为了验证MALDI-TOF MS所缺失质谱峰与SDS-PAGE所缺失条带的关系,我们对SDS-PAGE胶上的目的条带进行胰酶水解,并用MALDI-TOF/TOF MS进行分析及数据库比对,结果证明大肠埃希菌外膜蛋白MALDI-TOF MS所缺失的37,000-和38,000-m/z质谱峰分别对应SDS-PAGE上的40kDa的OmpF和41kDa的OmpC,肺炎克雷伯菌外膜蛋白MALDI-TOF MS所缺失的38,600-m/z质谱峰对应SDS-PAGE上的42kDa的OmpK36.与SDS-PAGE相比,MALDI-TOF MS具有操作简便,耗时短,分辨率高,影响因素少,结果易于观察等优点。 综上所述,碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌在我院克隆传播现象较为严峻;本研究建立了快速、准确、低成本、高通量检测革兰阴性杆菌碳青霉烯耐药决定子的方法,可用于检测碳青霉烯酶和外膜蛋白的表达情况。


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