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荷叶生物碱单体的分离纯化及其对3T3-L1前脂肪细胞作用的构效关系研究

刘晓琴  
【摘要】:荷叶(Lotus leaf)是睡莲科植物莲的叶,在我国的分布十分广泛。荷叶中含有大量的生物活性成分如生物碱、黄酮、p-胡萝卜素、多糖、有机酸、挥发性油类、甾体、皂类等,拥有抑菌、抗氧化、抗病毒和降脂减肥等作用,因而受到人们的广泛关注。据国内外文献报道,目前关于荷叶降脂减肥作用的研究主要集中于荷叶生物碱粗提物对高脂血症大鼠的作用研究,而关于荷叶提取物对3T3-L1前脂肪细胞作用的报道较少,荷叶生物碱单体对3T3-L1前脂肪细胞的作用及其构效关系则未见报道。随着人们生活水平的提高,肥胖尤其是肥胖儿童的增多,越来越引起人们的关注,因此开发出绿色、健康的降脂减肥食品或药物具有极其重要的现实意义。本文以荷叶为对象,研究荷叶生物碱提取物及其单体对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、周期、凋亡以及分化的作用,并进一步探索荷叶生物碱发挥预防肥胖作用的有效成分,研究结果可为天然降脂减肥食品或药物的开发提供依据。得到研究结果如下: (1)采用酸性乙醇溶液超声提取法,得到荷叶生物碱粗提物,并将其作用于3T3-L1前脂肪细胞,测定其对细胞增殖、周期、凋亡以及分化的相关作角。研究结果表明,荷叶生物碱粗提物能有效地抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,并呈剂量时间依赖效应,作用于3T3-L1前脂肪细胞24h、48h、72h的ICs0值分别为171μg/mL、153μg/mL、129μg/mL,作用效果显著。荷叶生物碱粗提物能显著作用3T3-L1前脂肪细胞的周期,并将其阻滞于G0/G1期,从而能显著抑制细胞增殖。PI/Annexin V-FITC双染结果显示荷叶生物碱粗提物能诱导3T3-L1前脂肪细胞的凋亡,并呈现剂量依赖性。在加入荷叶生物碱提取物后,3T3-L1前脂肪细胞的分化受到了不同程度的抑制,且随着加入浓度的升高,抑制作用也随之增强,当作用浓度为100μg/mL时,前脂肪细胞的分化OD值下降了36.7%,具有显著性差异。 (2)采用制备型高效液相色谱分离制备得到了6种荷叶生物碱单体,通过质谱、薄层色谱、紫外光谱以及分析型高效液相色谱鉴定,并对照文献推测可能为原荷叶碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱,纯度分别为91.9%、93.8%、83.5%、96.7%、91.8%、94.2%。首先使用制备型高效液相色谱进行荷叶生物碱的分离,制备条件为流动相乙腈和0.05%氨水配比为48:52,进样浓度为10mg/mL,进样量2mL/次,流动相流速为8mL/min,检测波长为270nm。在此条件下,分离制备得到4种荷叶生物碱单体,分别为巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和荷叶碱,再通过二次制备,条件为流动相乙腈和0.05%氨水配比为28:72,进样浓度为10mg/mL,进样量2mL/次,流动相流速为8mL/min,检测波长为270nm,在此条件下分离得到原荷叶碱和亚美罂粟。 (3)将分离纯化得到的6种荷叶生物碱单体分别作用于3T3-L1前脂肪细胞,测定其对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、周期、凋亡以及分化的相关作用,并进一步分析其构效关系。研究结果表明,6种生物碱单体对细胞增殖的抑制效果为N-去甲基荷叶碱巴婆碱O-去甲基荷叶碱荷叶碱,而原荷叶碱和亚美罂粟碱几乎没有抑制效果。对细胞周期的影响研究表明,巴婆碱将细胞阻滞于G2/M期,O-去甲基荷叶碱将细胞阻滞于G0/G1期,N-去甲基荷叶碱与荷叶碱均将细胞阻滞于S期。通过比较4种单体的促细胞凋亡作用,得到其作用效果由高到低为N-去甲基荷叶碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、荷叶碱,其作用效果基本与细胞的增殖抑制相类似。比较荷叶碱与N-去甲基荷叶碱对分化的抑制效果可以发现,荷叶碱对分化的抑制效果优于N-去甲基荷叶碱,这可能与N-去甲基荷叶碱对前脂肪细胞的增殖抑制作用太强有关,较低浓度的N-去甲基荷叶碱便能抑制前脂肪细胞增殖。同时,荷叶碱在较低浓度时就能起到很好的抑制分化的效果,而荷叶碱对增殖的抑制作用以及凋亡的促进作用均较弱,这说明前脂肪细胞的分化作用与增殖以及凋亡作用之间可能不存在联系。


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