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解淀粉芽孢杆菌的抑菌机理及对肉鸡生长代谢和盲肠微生物菌群的影响

曹广添  
【摘要】:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens, BAF)作为一种潜在益生菌,具备芽孢杆菌类菌种的抗逆性强、代谢产物多等特点,且已被广泛用于生物防治领域。此前对解淀粉芽孢杆菌的研究大多集中在抑制植物病原菌和真菌的作用机理。随着对解淀粉芽孢杆菌研究的深入,不断有报道称其在抑制动物病原菌和促进畜禽生长发育等方面同样效果显著。另一方面,试验技术的不断进步,尤其各类组学的发展使研究者可以更加全面、系统地探究疾病、环境变化、营养水平等因素对动物机体带来的影响。本研究分别围绕解淀粉芽孢杆菌的抗逆性、抑菌机理以及对肉鸡盲肠内微生物菌群结构和代谢物的影响进行了初步研究,旨在为解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌应用于畜禽生产中提供理论依据。试验一:解淀粉芽孢杆菌的抗逆性、粘附性和抑菌图谱本试验利用高温、模拟胃液、人工肠液等处理方式检测解淀粉芽孢杆菌的抗逆性,通过革兰氏染色的方法观察菌株粘附Caco-2细胞的能力,并利用牛津杯试验绘制BAF的抑菌图谱。试验结果显示,解淀粉芽孢杆菌有较好的耐高温和耐受人工胃液和肠液的能力:1)85℃处理后,活菌数超过57.4%;2)pH 2.0胃蛋白酶处理1 h后仍有36%活菌数;3)良好地耐受0.1%浓度的胆盐;4)胰蛋白酶处理3 h后活菌数没有发生显著性变化。采用革兰氏染色和常规计数的试验方法发现,BAF与Caco-2细胞共同孵育后,菌种定植数量随孵育时间的延长而迅速增加,2 h后可达到7.02±0.83 cell-1,说明菌种具有良好的细胞粘附性。利用菌落分析仪观察抑菌圈直观地显示了解淀粉芽孢杆菌具有较好的抑制动物病原菌能力,结果表明BAF发酵上清可以广谱抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和普通变形杆菌等病原菌,尤以48 h的发酵上清的抑制效果最好;另外,对肠道主要有益菌(嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌等)无抑菌效果。试验二:解淀粉芽孢杆菌的抑菌机理试验利用酸沉淀法得到解淀粉芽孢杆菌上清液中的脂肽类粗提物,并用牛津杯试验进一步验证其良好的抑菌作用。扫描电镜和透射电镜观察脂肽类粗提物的杀菌机制发现,其对病原菌的细胞膜具有一定的破坏作用;试验用来做比较的抗生素金霉素和硫酸新霉素同样具有破坏细胞结构的特点。之后利用液相色谱质谱联用仪检测了24-72 h BAF发酵上清中的脂肽类粗提物,发现其中主要的抑菌成分为伊枯草霉素A和表面活性素。解淀粉芽孢杆菌抑制病原菌粘附细胞的试验显示,其主要通过菌体的竞争性和排斥性抑制沙门氏菌和金黄色葡萄球菌对细胞的定植,菌体驱逐性试验和菌体上清液FST竞争性抑菌效果不显著。鼠伤寒沙门氏菌侵染Caco-2细胞后,流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果显示,BAF菌体及FST均不能降低细胞的凋亡率;同时对细胞做透射电镜的结果显示鼠伤寒沙门氏菌侵染后,细胞膜出现褶皱且胞内有空泡出现,但BAF及FST同样不能改善细胞形态;共聚焦显微图片也验证了流式细胞仪的结论,沙门氏菌侵染的细胞内活性氧荧光强度较对照细胞增强,BAF和FST的添加并不能改善遭受侵染的Caco-2细胞的胞内活性氧荧光的强度。上述试验说明解淀粉芽孢杆菌不能抑制鼠伤寒沙门氏菌对细胞的侵染。试验三:饲喂解淀粉芽孢杆菌对肉鸡生长性能、小肠发育、血液生化免疫指标、盲肠挥发性脂肪酸及菌群的影响试验选取1日龄健康肉鸡(Ross 308) 540羽,随机分为3个处理组(空白对照组、抗生素组、解淀粉芽孢杆菌组),每组6个重复,每重复30羽。试验肉鸡在第1、7、14、21、28、35和42日龄时宰杀,取样并检测各项指标。数据显示:相对于空白对照组,日粮中添加解淀粉芽孢杆菌增加了14-42日龄肉鸡的体重(P0.05),显著提高了8-14和1-42日龄肉鸡的平均日增重;增加了28日龄肉鸡回肠的体重校正长度(P0.05),显著增加14和28日龄肉鸡小肠的相对肠重。与对照组和抗生素组相比,解淀粉芽孢杆菌组42日龄肉鸡血清中总蛋白的含量显著增加,7和21日龄肉鸡血清中IgG和IgM的含量显著性提高。与空白对照组相比,解淀粉芽孢杆菌组肉鸡盲肠微生物菌群的多样性发生了显著性变化。另外,7日龄解淀粉芽孢杆菌组肉鸡盲肠内容物中丁酸和21日龄丙酸的浓度均显著高于对照和抗生素组肉鸡;解淀粉芽孢杆菌组组42日龄肉鸡盲肠内容物中乙酸、丙酸和丁酸的浓度显著高于对照组肉鸡。试验四:利用高通量测序研究解淀粉芽孢杆菌对肉鸡盲肠内菌群多样性的影响本试验结合高通量测序技术,对肉鸡盲肠内菌群的结构和多样性进行了研究。试验选取1日龄Ross 308肉鸡360羽,随机分为3个处理组(对照组、抗生素组、解淀粉芽孢杆菌组),每组6个重复,每重复20羽。试验肉鸡在第1、7、21和42日龄时宰杀,取盲肠内容物检测(每6只肉鸡盲肠内容物合为一管)。检测结束后,对测序质量进行评估,并分别就单样本OTU及多样本菌群多样性进行比较。试验结果显示:1)抗生素组肉鸡在7日龄时OTU数量显著低于解淀粉芽孢杆菌和对照组,但后两者间差异不显著;OTU等级显示微生物菌群序列深度基本覆盖样品中的所有物种,满足试验分析需要;2)不同时间不同试验组肉鸡盲肠均含有特异OTU;3)多样品间OTUs热图分析显示不同组肉鸡样本各自聚集在一起;4)OTU等级曲线显示21日龄肉鸡盲肠微生物OTU曲线坡度已趋于平缓,说明菌群分布均匀;5)群落结构图表明盲肠微生物在门水平上主要包含厚壁菌、变形菌、拟杆菌门和无壁菌门;属水平主要由Faecalibacterium、乳杆菌、粪芽孢菌、瘤胃球菌、厌氧原体、拟杆菌和变形杆菌等构成;6)物种多样性分析综合考虑了丰度指数、多样性指数和覆盖率指数等,数据显示解淀粉芽孢杆菌的添加不会对肉鸡盲肠菌群的多样性和相对丰度产生显著性改变,但抗生素的显著减少了早期肉鸡盲肠微生物的相对丰度及多样性;7)与7日龄对照组相比,解淀粉芽孢杆菌组肉鸡盲肠中优势菌颤螺菌(10.2%)、毛螺旋菌(10.9%)比例显著提高,抗生素组变形菌门、Blautia属(梭菌目)(3.8%)和乳杆菌(1.2%)显著增加;21日龄解淀粉芽孢杆菌组优势菌Faecalibacterium(16.4%),瘤胃球菌(12.6%),抗生素组肉鸡盲肠中优势菌Dorea(3.0%)显著性增加;42日龄解淀粉芽孢杆菌组盲肠内优势菌Faecalibacterium(22.4%)和拟杆菌(3.4%)的比例显著增加,抗生素组肉鸡盲肠中优势菌仅瘤胃球菌(7.1%)显著性地减少,其他菌群无差异性变化。试验五:代谢组学分析抗生素和解淀粉芽孢杆菌对生长初期肉鸡血浆和盲肠代谢产物的影响本试验利用代谢组学研究了采食添加抗生素和解淀粉芽孢杆菌日粮后,生长早期肉鸡血浆和盲肠中代谢产物的变化。1日龄Ross 308肉鸡360羽,随机分为3个处理组(空白对照组、抗生素组、解淀粉芽孢杆菌组),每组6个重复,每重复20羽。试验肉鸡在第1、7、14和21日龄时宰杀,并收集1、7、14和21日龄肉鸡盲肠样本和1日龄、21日龄肉鸡血浆样本。试验数据显示:1)PCA得分图上,各组在不同时间点均可较好地各自聚类,说明日粮中添加抗生素和解淀粉芽孢杆菌对肉鸡血清和盲肠中代谢产物产生一定影响。2)经过PLS建模和OPLS-DA筛选出主要差异性代谢产物,其中21日龄肉鸡血浆中,抗生素组20种差异代谢物发生显著性变化,缬氨酸、羟基脯氨酸、半乳糖酸、尿酸、草酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、棕榈油酸甲酯、单棕榈酸甘油酯等含量升高,主要涉及氨基酸代谢;解淀粉芽孢杆菌组共13种代谢物发生显著性变化,其中二羟基苯甲酸、α-D-磷酸葡萄糖胺、天冬氨酸、缬氨酸和蛋氨酸含量升高,主要涉及氨基酸代谢和脂肪酸代谢。3)21日龄肉鸡盲肠中,抗生素组9种差异性代谢物发生显著性变化,其中麦芽三糖与单棕榈酸三油酯含量升高,主要涉及碳水化合物消化与吸收和脂肪酸代谢;解淀粉芽孢杆菌11种差异代谢物发生显著性变化,其中龙胆二糖、奎尼酸、3,7,12-粪甾烷酸、甘氨酸、N-乙酰-D-半乳糖胺和丁胺酸等含量显著升高,主要涉及氨基酸代谢和甘油酯代谢。


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