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白细胞介素27抑制肥大细胞介导的免疫反应及其机制研究

万晓朋  
【摘要】:本论文分为两个部分:(1)接头蛋白TAB2信使RNA通过microRNA-155调节巨噬细胞内毒素耐受;(2)白细胞介素27抑制肥大细胞介导的免疫应答及其机制研究。第一部分接头蛋白TAB2信使RNA通过microRNA-155调节巨噬细胞内毒素耐受竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)是近几年新提出的一种RNA转录体之间的一种新的调控方式。拥有共同microRNA反应元件的RNA转录体通过竞争结合共同的microRNA从而调控彼此的翻译。已有研究表明,ceRNA的调节方式参与多种基因对肿瘤发生的调控过程。但是ceRNA的调节机制是否在天然免疫应答和内毒素耐受中发挥作用尚未报道。脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞会上调microRNA-155 (miR-155)的表达,在内毒素耐受过程中发挥作用,miR-155可以靶向LPS-TLR4信号通路中的多个分子,包括MyD88, TAB2, SOCS1, β-arrestin2和SHIP1等。我们检测了在LPS刺激巨噬细胞后,上述几个分子的表达丰度及其变化。发现TAB2 mRNA是在上述分子中表达最高的,也是变化最剧烈的。SOCS1是一个诱导性表达的基因,表达倍数有明显增加。我们提出假设:这些分子之间会不会通过miR-155形成一个调控网络在内毒素耐受中发挥作用?我们通过一系列实验,揭示了巨噬细胞中TLR4信号通路中接头蛋白TAB2与TLR4通路的负向调节分子SOCS1,竞争结合miRNA-155, TAB2 mRNA可能以ceRNA的方式上调SOCS1的蛋白表达,从而在巨噬细胞内毒素耐受过程中发挥精细调节作用。首先,构建了TAB23'UTR稳定过表达的小鼠巨噬RAW264.7细胞系,诱导内毒素耐受的模型,与对照细胞相比,可以检测到此细胞系中SOCS1蛋白的表达明显上调,而分泌的细胞因子IL-6和TNF-a水平相应的下降。用siRNA敲减RAW264.7中TAB2 mRNA的表达,检测到SOCS1蛋白表达显著下降,同时细胞上清中的IL-6和TNF-a的含量相应地升高。为了说明TAB2 mRNA调控SOCS1蛋白是依赖于miR-155,同时干扰miR-155和TAB2 mRNA的表达,在上述内毒素耐受的细胞模型中则SOCS1的蛋白水平则无明显变化。这说明,TAB2 mRNA除了作为信使RNA翻译目的蛋白质外,还可能在microRNA的调控网络中发挥作用,通过microRNA去间接调控其他基因的蛋白水平。上述实验结果提示,在内毒素耐受的巨噬细胞中,TAB2mRNA通过竞争结合miRNA-155,导致结合到SOCS1mRNA上的miR-155减少,从而上调SOCS1蛋白的表达,从而在内毒素耐受中的调控中发挥作用。上述研究初步揭示了ceRNA可能是参与内毒素耐受调控的一种新的方式,为深入研究内毒素耐受的机制提供了新的认识,也可能为感染性疾病的诊断和治疗提供新的思路。第二部分白细胞介素27抑制肥大细胞介导的免疫应答及其机制研究白细胞介素27(Interleukin27,IL-27)最初是作为可以促进Thl型应答而被认知的一种细胞因子,而随后的研究证明IL-27具有重要的抑制炎症的功能。肥大细胞是介导过敏反应的主要效应细胞,也是1gE相关疾病主要的效应细胞。我们前期实验发现,IL-27处理后肥大细胞表面IL-27受体亚基WSX-1和gp130的表达上调,WSX-1缺陷的小鼠来源的肥大细胞对IgE触发的应答增强,提示IL-27可能对肥大细胞的功能具有调控作用。本研究的目的是研究IL-27对肥大细胞介导的免疫应答的抑制效应及其相关机制。我们利用WSX-1缺陷和野生型的小鼠,建立了肥大细胞活化为主的三个疾病模型:被动性全身超敏反应、被动皮肤过敏反应和慢性气道炎症模型。结果显示:与野生型(WT)小鼠比较,IL-27受体亚基WSX-1缺陷的小鼠(WSX-1-/-)的小鼠表现出更严重的全身性过敏反应和局部皮肤过敏反应,相应的血中组胺产生水平也升高。慢性气道炎症模型显示:WSX-1-/-的小鼠肺脏中有更严重的炎性细胞的浸润,以噬酸性细胞和杯状细胞浸润为主,WSX-1-/-的小鼠有更多的Th2型、炎性相关细胞因子包括IL-4,IL-5,IL-13等的分泌。在体外用重组IL-27处理WT和WSX-1-/-小鼠骨髓来源的肥大细胞,WSX-1-/-来源的肥大细胞分泌更多的Th2型和炎性相关的细胞因子,并且脱颗粒程度较之野生型小鼠来源的肥大细胞有明显增加。与野生型(WT)小鼠相比,WSX-1-/-小鼠骨髓来源的活化的肥大细胞,其主要信号途径Grb2/PLC-γ1-SLP-76和旁路信号通路P13K/Akt/IκBα,以及下游的MAPK和钙离子流有明显的增强,而且连接FcεRI受体和下游信号的关键分子lyn的磷酸化水平也明显增强。我们的结论是:IL-27通过抑制PLC-γ/SLP-76信号通路和旁路信号通路负向调控肥大细胞介导的超敏反应和慢性炎症反应。上述研究为揭示肥大细胞介导的免疫应答和机体维持免疫稳态的调控分子机制提供了一定的依据,也为深入研究白细胞介素27的生物学功能提供了新的认识,并可能为相关的过敏反应性疾病的诊治提供启示。


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