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胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的制备和抗肿瘤作用研究

汤沁  
【摘要】:研究目的:在本实验室已有抗胃癌单链抗体库的基础上,研究单链抗体的表达方法;通过基因融合技术,将单链抗体与天花粉蛋白连接构成免疫毒素scFv-TCS,通过基因表达获得重组免疫毒素,在培养细胞和小鼠移植肿瘤模型中,研究其抗肿瘤作用。研究方法:第一部分:单链抗体在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达将cFv插入原核表达载体PET30a质粒,转入E. coli BL21(DE3),37℃,1mM IPTG诱导表达3h,离心收集菌体,超声破碎显示scFv以包涵体形式表达,在8M尿素变性环境下经Ni-NTA树脂纯化后逐级降低尿素浓度,最终透析至PBS中,得到可溶性scFv。将scFv插入真核表达载体pPIC9质粒,转入毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达120 h,得到scFv蛋白。第二部分:免疫毒素scFv-TCS在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达将scFv基因与天花粉蛋白(TCS)基因通过接头GGGGS融合,插入原核表达载体PET30a质粒,转入E. coli BL21(DE3),30℃,1 mM IPTG诱导表达3 h,离心收集菌体,超声破碎显示scIT以包涵体形式表达,在8M尿素变性环境下经Ni-NTA树脂纯化后逐级降低尿素浓度,最终透析至PBS中,得到可溶性scIT。将scIT插入真核表达载体pPIC9质粒,转入毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达120h,得到scIT蛋白。第三部分:体外和体内抗肿瘤作用研究体外实验,用MTT法测定scFv和scIT对人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞和人正常胃上皮GES-1细胞的毒性。体内试验,裸鼠皮下接种3×106人胃癌MGC-803细胞,成瘤率达100%,尾静脉注药scFv、scIT、TCS。第四部分:抗HER2抗体对HER2高表达胃癌的检测免疫新西兰兔获得抗HER2胞外区多克隆抗体,与HER2高表达人胃癌NCI-N87细胞检测结合力,对27位胃癌患者肿瘤切片进行免疫组化检测。研究结果:1.scFv蛋白在大肠杆菌中,37℃,1 mM PTG诱导3 h后超声破碎菌体,得到27kD的条带,显示以包涵体形式表达,经纯化透析复性后得到目的蛋白;在酵母系统中经过120 h甲醇诱导后以分泌蛋白形式表达,但表达量不高。2.scIT蛋白在大肠杆菌中,30℃,1 mM IPTG诱导3h后超声破碎菌体,得到60 kD的条带,显示以包涵体形式表达,经纯化透析复性后得到目的蛋白;在酵母系统中经过120h甲醇诱导后以分泌蛋白形式表达,但表达量不高。3.scFv、scIT在体外实验中,对MGC-803细胞具有毒性;体内实验显示scFv、scIT均具有抑制肿瘤生长作用。4.抗HER2-ECD抗体可以特异性结合HER2高表达胃癌NCI-N87细胞,与HER2低表达胃癌MGC-803细胞不结合,对27例胃癌患者的检测结果得到4例IHC阴性,7例IHC 1+,11例IHC 2+,5例IHC 3+。结论:成功表达并纯化scFv和免疫毒素scFv-TCS蛋白,在裸鼠移植性人胃癌模型中显示对胃癌生长的抑制作用;获得具有高特异性的抗HER2抗体,可用于检测胃癌患者HER2表达水平。


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