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抗CD33单链抗体及免疫毒素scFv-Gz B的制备及活性检测

张珍珍  
【摘要】:研究背景:白血病严重威胁人类的健康。据统计,我国白血病的发病率在各种肿瘤中居第六位。目前针对白血病的治疗仍主要采用骨髓移植和化疗等方法,但存在术后复发、毒副反应等问题。免疫疗法成为继化疗和骨髓移植后治疗白血病的新方法,因其毒副作用低、特异性强等优点而得到广泛应用;在常规化疗和移植过程中联合抗体治疗,也取得了良好的效果。近年来随着抗体人源化技术的进步,抗体药物在肿瘤临床治疗领域取得了突破性进展,并逐渐成为全球生物制药领域的热点。研究目的:本实验室以构建好的全人源白血病噬菌体抗体库为基础,成功筛选出与白细胞分化抗原CD33胞外区蛋白特异性结合的单链抗体(scFv)。表达与CD33胞外区蛋白结合性高的scFv并检测其相关活性;构建scFv与人颗粒酶B(Gz B)融合的免疫毒素scFv-Gz B,并对其进行表达及活性检测;将活性高的单链抗体及免疫毒素成功转入酵母表达体系并大量表达。研究方法:通过ELISA等方法测定单链抗体与CD33胞外区蛋白的结合力,选取结合力较强的序列分别设计相应引物,用体外PCR方法扩增阳性噬菌体抗体基因(1号,23号,76号),通过引入酶切位点将目的片段重组至表达载体PET30a(+)中,进而转化至E.coli BL21中,表达出单链抗体并检测其活性;同时设计相应引物及Linker将scFv转入实验室已构建并保存的颗粒酶B (PET30a-Gz B)重组载体中,表达免疫毒素并测定其生物学活性。研究结果:成功构建三株单链抗体及对应的单链免疫毒素表达载体,并在大肠杆菌和甲醇酵母体系中表达、纯化得到活性蛋白。经ELISA及Western Blot验证,所表达三株scFv与CD33均有较强的结合;经体外细胞毒性测定,1号scFv及1号/76号scFv-Gz B均对CD33阳性白血病细胞有杀伤作用。结论:成功表达、纯化三株单链抗体及相应的免疫毒素,并对其活性进行了初步研究,为后期进一步的功能分析打下了基础,为CD33阳性白血病的治疗提供了可能。


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