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杨梅叶原花色素的结构鉴定以及对黑色素生成和细胞凋亡的作用研究

傅瑜  
【摘要】:杨梅(Myrica rubra Sieb. et Zucc., Myricaceae)是华南亚热带常绿果树,近年来对杨梅叶的研究主要集中于从中分离出来的杨梅黄酮,而对于杨梅叶原花色素的研究十分有限。原花色素(PAs)是在植物中分布范围仅次于木质素的次生代谢产物。本实验室的前期研究结果表明杨梅叶富含原花色素,且大部分杨梅叶原花色素为原飞燕草素。由于原花色素为聚合物,存在大量结构相似的同分异构体,导致其分离方法十分复杂,给杨梅叶原花色素的研究带来了困难。本文主要以杨梅叶为研究对象,按照聚合度的不同分离原花色素,对其结构组成进行进一步分析鉴定,并在此基础上研究了它对黑色素生成的抑制作用和对细胞凋亡的诱导机理。为了杨梅叶原花色素可以更好的应用到实际的加工利用中,本文还研究了外界条件以及常用化学基质对杨梅叶原花色素稳定性的影响。主要的研究内容如下:(1)将杨梅叶通过80%丙酮萃取,Sephadex LH-20柱纯化后得到杨梅叶原花色素的粗提物PCBLs。通过其核磁共振结果证明了杨梅叶原花色素主要由表棓儿茶素棓酸酯(EGCG)的结构单元组成。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定杨梅叶中的原花色素聚合物结构,并检测出95种可能的结构。此外,运用正相液相色谱质谱联用鉴定低聚原花色素的可能结构,并以此为依据采用正相制备色谱根据聚合度分离杨梅叶原花色素,然后运用反相色谱-电喷雾离子化质谱联用进一步分析,共鉴定出了20种化合物,包括杨梅叶中新被发现的7种化合物,其中原花色素四聚体、A型连接键和包含两个(E)GC和一个(E)GCG的三聚体的结构都是首次报道。将正相制备色谱中纯化到的馏分进行组合,分为低聚原花色素(OPAs)和高聚原花色素(PPAs)。OPAs是正相制备液相分离得到的仅含二聚体和三聚体的低聚体提取物,PPAs是包含四聚体及以上的多聚体提取物。以OPAs、PPAs和粗提物PCBLs为实验样品,研究其对黑色素生成和细胞凋亡的影响。(2)通过研究杨梅叶原花色素对蘑菇酪氨酸酶的抑制、对小鼠B16黑色素瘤细胞的存活率、细胞内酪氨酸酶活性和细胞内黑色素含量的影响、抗氧化性以及对对虾黑变的影响,表明了杨梅叶原花色素具备抑制黑色素生成的能力。PPAs虽然对细胞内酪氨酸酶的活性的抑制能力比OPAs弱,但其对蘑菇酪氨酸酶的活性,对细胞内黑色素的含量的影响都比OPAs强。(3)通过Hoechst 33342 DNA染色和Annexin V+/Pr染色证明了PCBLs、 OPAs和PPAs对卵巢癌OVCAR-3细胞凋亡起剂量依赖性的诱导作用,PPAs比OPAs对细胞凋亡的诱导作用更有效。PCBLs、OPAs和PPAs都对caspase 3/7,8,9有强烈的剂量依赖性的激活作用。细胞经过20或40 μg/mL浓度的PPAs处理后,对Caspase 3/7,8,9的激活效果最强。通过Western Blot进一步研究发现,PCBLs、OPAs和PPAs增加了促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma、Bax和Bad的表达,降低了抑凋亡蛋白Bcl-xL的表达,表明其在内凋亡途径中发挥了作用。PCBLs、OPAs和PPAs增加了DR5和Fas的表达,证明其对外凋亡途径也有影响。此外,实验结果表明PCBLs对AKT和p53的表达没有明显的作用,但是OPAs和PPAs对AKT和p53的表达有显著的影响。虽然不确定高聚体原花色素能否被吸收利用,但实验结果显示PPAs(四聚体及更高聚合度的原花色素)整体上比OPAs(二聚体和三聚体)有更高的细胞毒性和更强的细胞凋亡活性。(4)通过稳定性研究发现,外界条件中,自然光、D65和UV光源会一定程度上降低稳定性;在30℃到80℃的范围内,杨梅叶原花色素基本稳定;在pH值为4.3-8.0范围内,杨梅叶原花色素比较稳定。此外,杨梅叶原花色素对Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+这四种常见金属离子十分敏感。在常用化学基质中,硼酸以影响pH的方式影响原花色素的稳定性,保湿剂丙三醇比透明质酸钠对杨梅叶原花色素的稳定性影响更小,防腐剂尼泊金甲酯对原花色素无显著性影响,VC可以有效帮助提高杨梅叶原花色素的稳定性。综上所述,杨梅叶原花色素的主要结构单元为EGCG,能有效的抑制黑色素的生成和诱导卵巢癌细胞的凋亡。它的稳定性良好,具备添加到食品和化妆品中的条件。因此杨梅叶原花色素是一种具有广阔开发前景的天然产物资源。


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1 傅瑜;杨梅叶原花色素的结构鉴定以及对黑色素生成和细胞凋亡的作用研究[D];浙江大学;2015年
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