酯酶响应肿瘤细胞选择型基因输送体系应用于肿瘤基因治疗的研究

【摘要】：肿瘤内成纤维细胞是肿瘤重要的支撑组成部分,对肿瘤的发生、发展及其耐药和转移重扮演着极为重要的角色。目前研究发现,当成纤维细胞受到如化疗药物引起的损伤时,会分泌大量WNT16B等信号分子,促使肿瘤细胞的耐药、转移和复发。传统化疗药物选择性差,在杀伤肿瘤细胞的同时,会不可避免地损伤肿瘤成纤维细胞,导致其疗效差。运用基因治疗的手段从源头上改变肿瘤细胞自身蛋白表达,使其分泌大量的治疗蛋白,或是沉默致病基因表达,不仅作用持续时间久,还可以通过载体的设计实现特异性杀死肿瘤细胞而不刺激肿瘤反弹通路,从而克服化疗药物非选择性杀伤引起的毒性和肿瘤反弹。但是,如何实现基因治疗选择性地杀死肿瘤细胞而不伤害成纤维细胞是至今未解决的难题。阳离子聚合物作为非病毒载体被广泛地应用于基因输送,其与DNA形成的纳米复合物必须在细胞核或细胞内有效解离,才能使DNA高效表达。一般情况下,阳离子聚合物与带负电荷DNA之间的强静电相互作用使得纳米复合物难以解开释放DNA。因此,通过控制纳米复合物在细胞内的解离即可起到调控其基因表达的目的。我们发现,肿瘤细胞内酯酶的活力远远高于成纤维细胞,由此我们设想：在酯酶催化下能够从正电变为电中性或负电荷的阳离子聚合物,其与DNA形成的纳米复合物将能够在肿瘤细胞内由于聚合物失去正电荷而有效地与DNA解离、使DNA能够表达治疗蛋白而杀死肿瘤细胞；而在成纤维细胞中,由于低的酯酶活性使该聚合物仍保持正电性而不能释放DNA、DNA不能有效表达从而不能产生治疗蛋白,进而不会损伤成纤维细胞,从而实现肿瘤细胞选择性的基因治疗。本论文第一部分设计并合成了一种可以响应肿瘤细胞内酯酶而实现电荷翻转的阳离子聚合物(Esterase responsive gene delivery polymer,简写为ERP)[N-丙酸(4-乙酰氧基)苄基酯]-N-甲基季胺化聚乙烯亚胺(N-[3-(p-acetyloxybenzyloxyoxo)propyl)]-N-methyl-quaternized PEI)。ERP在阳离子态时能够有效包裹压缩DNA,形成粒径在80 nm左右、电势为10 mV的稳定的纳米颗粒。进入细胞后,在细胞内酯酶的作用下,ERP的乙酰酚基酯会快速水解,触发释放酚基苄醇的反应,直接生成羧酸根而与氨基形成中性的聚离子对,实现了阳离子聚合物的电势由正向负的转变,使聚合物失去与DNA的电荷相互作用而使复合物快速解离并释放出DNA。同时,电中性的聚合物大大降低了对转录和翻译过程的干扰,从而提高了基因表达效率。与不能进行电荷反转的碘甲烷季胺化的聚乙烯亚胺QPEI-M和不带酚基酯键的对照载体QPEI-BP相比,其转染效率提高了100至1000倍；并且由于DNA的快速释放,使得转染2小时后ERP/pLUCI表达荧光素酶即达到106RLU/毫克蛋白,为阳性对照PEI/pLUCI的100倍。同时,由于肿瘤细胞HeLa中酯酶的含量显著高于成纤维细胞NIH3T3, ERP/pLUCI在HeLa细胞中的表达效率是NIH3T3细胞中的1000倍,实现了在肿瘤细胞中的选择性转染及表达目的蛋白。本论文第二部分是基于上述酯酶响应的电荷反转型聚合物设计了弱正电性脂质层DC-Chol/DOPE包裹的ERP/DNA'‘核壳”式纳米复合物(lipid-coated esterase-responsive charge-reversal polyplexes, LERPs)应用于体内HeLa腹腔瘤模型的转染和抑瘤。在体内富含酯酶的环境中,DC-Chol/DOPE脂质层有效地保护ERP/DNA复合物使其在到达肿瘤细胞前保持足够的稳定性；在进入肿瘤细胞后,LERPs/DNA可迅速地蜕去脂质体外壳、暴露出ERP/DNA,响应细胞内酯酶的水解快速释放DNA进行转染。体外细胞转染实验证实LERPs/pLUCI在100%血清中仍有高达107数量级的蛋白转染效率,且具有基因高阳性表达率,并仍保持在肿瘤细胞上的优先表达(相对于对成纤维细胞NIH3T3)。在体内HeLa腹腔瘤荷瘤鼠模型上,LERPs/pLUCI实现了100%的体内转染效率,转染后肿瘤组织中荧光素酶表达值比Lipo2000高出近百倍,比PEI25K体系高出近千倍。在此基础上,我们利用LERPs输送肿瘤自杀基因TRAIL(LERPs/pTRAIL),比较了基因输送体系LERPs/pTRAIL与阳性对照体系PEI25K/pTRAIL的基因治疗和三种宫颈癌临床化疗药物伊立替康(CPT11)、紫杉醇(PTX)和顺铂(CDDP)的疗效,发现LERPs/pTRAIL的基因治疗比化疗药物有着更好的抑瘤效果并能有效地抑制肿瘤的转移与反弹,大大地延长了荷瘤鼠的生存期。机理研究表明,LERPs/pTRAIL能够更有效地杀伤肿瘤细胞,而对肿瘤组织成纤维细胞几乎没有影响,使成纤维细胞不会大量分泌促肿瘤细胞生长和转移的因子WNT16B。生物安全性实验表明LERPs/pTRAIL与化疗药物相比具有更好的生物安全性。在HeLa皮下瘤模型和的膀胱癌腹腔瘤模型上进一步验证了LERPs/pTRAIL很好的抑瘤效果和选择性杀伤肿瘤细胞而对肿瘤微环境中其他细胞影响很小的特性。本论文第三部分进一步设计了具有清晰化学结构的酯酶响应型阳离子聚合物体系：4-乙酰氧基苄氯季铵化的聚[2-(N.N-二烷基氨基)乙基聚丙烯酸酯]。通过将烷基改变为甲基、乙基或丁基,制备了三种疏水性逐渐增加的季胺化聚合物(PQDMA、PQDEA、PQDBA)。在HeLa细胞上的转染实验证实侧链为乙基时的PQDEA/DNA纳米复合物转染效果最好,其次为PQDBA、PQDMA的纳米复合物。PDEA分子量为14KDa时的季胺盐PQDEA转染效果最高,可达到108RLU/毫克蛋白的转染效率,且纳米复合物入胞的速度、入胞的量和破溶酶体的速度都要优于PEI25K/pLUCI。将LERPs/pDNA体系的脂质层引入到PQDEA/DNA纳米复合物上,制备了脂质化纳米复合物体系LPQDEAs/pDNA,应用于输送治疗基因TRAIL。在细胞水平验证了其转染效率和诱导HeLa细胞凋亡的能力,在体内HeLa腹腔瘤模型上进行了抑瘤实验和疗效评估,证明LPQDEAs/pTRAIL与化疗药物治疗相比可以显著延长荷瘤动物的生存期。最后在LPQDEAs/DNA的表面引入PEG化脂质DSPE-PEG和TPGS,制备了长循环脂质化纳米复合物,细胞水平上证实了长循环遮蔽层的引入没有显著降低转染效率,可用于尾静脉注射的皮下瘤模型的治疗。