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人乳头瘤病毒致宫颈癌的型别特异性差异的研究

邹健  
【摘要】:在世界范围内,宫颈癌是女性第二大常见的恶性肿瘤,每年有527,624个新发病例和265,653个死亡病例(www.hpvcentre.net in Oct 31th,2014),其中85%的宫颈癌发生在发展中国家。宫颈癌病因明确,大量的研究表明高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌及癌前病变的主要致病因素。HPV分高危型和低危型,高危型包括:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、 HPV56、HPV58、HPV61等。研究表明,HR-HPV表达的病毒癌基因E6和E7,可分别结合降解宿主细胞P53和Rb,引起细胞周期、增殖、侵袭、转移等生物学行为改变,促进细胞的恶性转化,最终导致宫颈癌发生与进展。但对不同型别的病毒癌蛋白之间是否存在差异尚不清楚。流行病学证据显示,各种型别HPV在细胞学正常妇女和不同宫颈病变患者中的感染频率并不相同,反应了不同型别病毒感染力和致病力的不同,但是否与宿主对HPV型别特异的易感性有关所知甚少。本研究从不同型别HPV致宫颈癌能力差异和不同型别HPV感染宿主是否与宿主易感性有关两方面进行研究,首先通过设计两条HPV58 E6特异性多肽片断,将多肽交联至三种不同载体蛋白,免疫兔子,获得特异性HPV58 E6兔单克隆抗体。其次,通过构建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16 E6/E7真核生物表达质粒,转染293T和U20S细胞,观察HPV58E6/E7和HPV16 E6/E7基因对细胞的周期、凋亡、侵袭能力的差异及下游分子的表达差异,比较两者致癌能力的差异。最后,收集3299例宫颈脱落细胞样本,选出875例单纯HPV16,18,52,58阳性和HPV阴性,提取DNA,通过Illumina BeadXpress VeraCode platformSNP分型检测技术,对HPV感染相关受体基因(EGFR, PPIB, HSPG2, FGFR2, FURIN, ITGA6, TSPAN1和SDC2)上的96个tagSNP位点进行检测,分析目的基因SNP与型别特异HPV感染和官颈病变进展的相关性。本研究首次成功获得了HPV58E6单克隆抗体;在体外实验中验证了相比HPV58E6/E7, HPV16E6/E7具有更强的促细胞周期进程、抑制细胞凋亡、促进细胞侵袭的能力,进一步揭示了E6-P53和E7-pRB在HPV致癌过程中所起的关键作用;还发现了与HPV型别特异性感染及其致宫颈病变进展相关的差异宿主SNP位点,基因型及单倍型。本研究初步阐述了HPV在自然界的分布规律和不同病变中分布特征的相关机制,更好地了解了HPV的致癌中的型别特异性差异,为制定有针对性的宫颈癌防控策略提供了科学证据。第一部分 HPV58E6兔单克隆抗体的制备目的:研发HPV58E6特异性兔单克隆抗体,为进一步体外研究HPV58E6提供基础。方法:通过将HPV58E6序列与HPV16E6,HPV31E6,HPV33E6,HPV52E6,HPV67E6等同源性较高的序列进行比对,找出HPV58E6的特异性序列,针对该特异性序列设计两条HPV58E6多肽片断,将其交联至三种不同载体蛋白,免疫新西兰大白兔,获得免疫血清,取血清筛选出抗体阳性的大白兔并做ELISA确定滴度,分离筛选出的大白兔脾细胞并与融合伴侣细胞240E-W2进行细胞融合,之后铺板到96孔培养板,在1640AB培养基中进行克隆培养,对细胞上清进行ELISA筛选,找到表达HPV58E6特异性抗体的阳性细胞克隆,针对阳性克隆,提取细胞RNA,用引物F1/R1进行RT-PCR扩增,得到多个重链cDNA和多个轻链cDNA;将cDNA分别构建到pTT5质粒表达载体中,将包含重链cDNA的pTT5质粒与包含轻链cDNA的pTT5质粒进行两两配对,共转染到HEK-293-6E细胞后进行细胞培养;取细胞培养的上清液,进行ELISA检测;筛选IgG浓度最高且滴度OD值大于0.3的配对,即为HPV58E6特异性兔单克隆抗体的重链和轻链配对。制备重组抗体并进行测序分析,从而获得特异性HPV58E6兔单克隆抗体。结果:1.设计的特异性HPV58E6多肽片段免疫新西兰大白兔后获得的血清能够结合pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染293T细胞所提取的蛋白。2.杂交瘤细胞上清在pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组未见条带,而在pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组可见条带。3.重组抗体ZJM1B-9在pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组未见条带,而在pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组可见条带。结论:1.采用杂交瘤技术可以成功获得抗HPV58E6兔单克隆抗体。2.获得的抗HPV58E6兔单克隆抗体可以特异性结合HPV58E6蛋白,而不能结合HPV16E6蛋白。第二部分:HPV58与HPV16 E6/E7致官颈癌功能差异的研究目的:明确HPV16与HPV58癌基因E6/E7在细胞表型方面的差异,及E6-P53和E7-pRB的表达和定位的区别,从细胞表型和分子水平阐述两种病毒致癌能力的差异。方法:通过构建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16E6/E7真核生物表达质粒,转染293T和U20S细胞,通过流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,CCK8检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞侵袭能力,免疫荧光共聚焦拍摄细胞E6-P53和E7-pRB的共表达和共定位,比较HPV58E6/E7和HPV16E6/E7基因对细胞周期、凋亡、侵袭能力的差异及下游分子的表达差异。结果:1.在293T和U20S细胞中,相比阴性对照组,HPV58E6/E7过表达能促进细胞增殖;相比]HPV58E6/E7, HPV16E6/E7过表达促进细胞增殖能力更强。2.在293T细胞中,HPV58E6/E7组细胞周期S期比例分别为42.68%和45.39%,而HPV16E6/E7组细胞周期S期比例分别52.66%和49.18%。在U20S细胞中,]HPV58E6/E7组细胞周期S期比例分别为32.73%和27.03%,而HPV16E6/E7组细胞周期S期比例分别37.32%和36.24%。3.在293T细胞中,]HPV58E6/E7组细胞早期凋亡比例分别为9.66%和12.1%,而HPV16E6/E7组细胞早期凋亡比例分别为6.6%和14.0%。在U20S细胞中,HPV58E6/E7组细胞早期凋亡比例分别为5.63%和5.22%,而HPV16E6/E7组细胞早期凋亡比例分别为3.84和3.44%。4.在293T和U20S细胞中,相比阴性对照组,HPV58E6/E7组细胞侵袭能力增强;相比HPV58E6/E7, HPV16E6/E7组细胞侵袭能力更强。5.在293T和U20S细胞中,相比HPV58E6组,HPV16E6组P53下降更显著,且胞核内表达更低;同时相比HPV58 E7组,HPV16E7组pRB表达增多,且在核内表达更多。结论:与HPV58 E6/E7相比,HPV16 E6/E7显示了更强的促进细胞周期进程、抑制细胞凋亡、促进细胞侵袭能力和降解P53和pRB能力,提示HPV16比HPV58具有更强的致癌力。第三部分:HPV相关受体基因变异与型别特异官颈感染和病变进展的相关性研究目的:明确不同个体之间的HPV感染相关受体是否存在型别特异的与宫颈感染和病变进展的相关的单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs).方法:在3299例宫颈脱落细胞样本中,挑选出单一HPV16,18,52,58阳性和HPV阴性,共875例,提取DNA,通过Illumina BeadXpress VeraCode platform SNP分型检测技术,对HPV感染相关受体基因(EGFR, PPIB, HSPG2, FGFR2, FURIN, ITGA6, TSPAN1和SDC2)上的96个tagSNP位点进行检测,分析目的基因SNP与型别特异HPV感染和官颈病变进展的相关性。在对照组中检验Hardy-Weinberg平衡。运用Haploview, SPSS16.0, PLINK等软件分析SNP结果。结果:对病毒型别特异性感染的易感性分析显示,HPV16有2个SNP(rs28384376, rs12034979)显著相关和3个单倍型("GGAA", "GGGG"和“GA”)临界相关,HPV18有4个SNP(rs2575738, rs6697265, rs2575712, rs2575735)和3个单倍型(“GGG”,“GGA”和"GGAGA")显著相关,HPV52有2个SNP (rs10510097, rs12718946)和2个单倍型("GGGAA"和“GGA”)显著相关,HPV58有3个SNP (rs4947972, rs2981451, rs2575735)和2个单倍型(“GC”和“GA”)显著相关。对病毒型别特异性宫颈病变进展的易感性分析显示,HPV16有5个SNP(rs3135772, rs2556537, rs12034979, rs1047057, rs16894821)和1个单倍型(“GG”)显著相关,HPV18有3个SNP (rs6697265, rs6680566, rs16860426)和1个单倍型(“GG”)显著相关,HPV52有3个SNP (rs878949, rs12718946, rs12668175)和1个单倍型(“CAA”)显著相关,HPV58未见有显著相关的SNP位点和单倍型。结论:宿主HPV感染相关受体不同的基因变异呈现了不同的病毒型别特异感染和病变进展的易感性,可能在宫颈癌筛查中有潜在的应用价值。


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