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Slug与c-Met的新型调控方式在高转移卵巢癌治疗中的作用研究

付颖颖  
【摘要】:目的:卵巢癌(Ovarian Cancer)是我国死亡率最高的妇科恶性肿瘤,造成其致死率高的重要原因之一是转移的发生。然而目前针对卵巢癌转移以及转移后出现的药物敏感性下降等问题,缺乏有效的治疗手段。因此了解卵巢癌细胞获得高转移能'力的机制,挖掘参与其中的关键分子和信号通路,将有助于寻找针对性的药物和策略,从而提高转移性卵巢癌的治疗效果。因此,本课题通过对卵巢癌SKOV3细胞进行运动能力的筛选,构建了一株具有较高转移潜能的卵巢癌高转移细胞株SKOV3/T4,并通过考察其与亲本SKOV3细胞的运动能力及转移相关信号通路等方面的差异,研究参与卵巢癌转移的发生发展机制及关键分子,以期为临床高转移性卵巢癌的治疗提供新的思路。方法:(1)采用 Wound Healing 和 Transwell 实验观察 SKOV3/T4 细胞株与 SKOV3亲本细胞株运动迁移能力的差异,采用鸡胚尿囊膜模型(chorioallantoicmembrane,CAM)考察SKOV3/T4细胞株与亲本细胞株血管扩散能力的差异;(2)采用WesternBlot及免疫荧光实验观察上皮间质转化相关蛋白及c-Met、EGFR、VEGFR信号通路相关蛋白的表达和磷酸化情况;(3)釆用Real-Time PCR法检测上皮间质转化相关蛋白及c-Met信号通路相关蛋白mRNA的表达情况;(4)采用免疫组化实验考查临床样本中Slug蛋白表达和c-Met磷酸化之间的相关性;(5)采用酶联免疫检测法(Enzyme-linked immuno-sorbent assay,Elisa)检测细胞上清中 HGF 的分泌水平;(6)通过 siRNA 转染技术沉默 Slug、IntegrinαV、Fibronectin 观察 c-Met蛋白磷酸化水平的变化;(7)通过质粒转染技术过表达Slug质粒观察SKOV3细胞EMT相关蛋白、细胞运动能力及c-Met蛋白磷酸化水平的变化;(8)采用SRB法检测SKOV3/T4细胞与亲本细胞株的药物敏感性差异,以及干扰Slug与c-Met相关通路后的药物敏感性差异;(9)采用裸小鼠移植瘤模型考察多柔比星(ADR)及XL184对SKOV3/T4与亲本SKOV3的体内药效学差异。结果:1、高转移卵巢癌细胞株SKOV3/T4细胞株的构建与验证我们通过收集经Transwell小室实验进入Transwell下室的细胞,并将收集到的细胞重复实验四次,最终获得SKOV3/T4细胞株。经Transwell及划痕损伤修复实验证明,SKOV3/T4细胞株比SKOV3亲本细胞株具有更强的运动迁移能力,鸡胚尿囊膜的实验表明SKOV3/T4细胞株比亲本细胞具有更强的血管扩散能力。2、SKOV3/T4细胞发生上皮间质转化且转录因子Slug在其中发挥重要作用随后,我们用Western Blot、免疫荧光的方法检测了上皮间质转化过程中的重要蛋白分子标记物,发现SKOV3/T4细胞株与亲本相比,上皮标志蛋白下调,间质标志蛋白上调,发生了上皮间质转化。用RT-PCR的方法检测了 EMT发生过程中重要转录因子的表达情况,结果发现SKOV3/T4细胞中转录因子Slug的表达上调,而其他转录因子未见明显变化。在SKOV3细胞中过表达转录因子Slug后,Western Blot的结果表明,细胞发生上皮间质转化,且Transwell小室实验也表明,细胞的运动能力得到明显增强。3、SKOV3/T4细胞中c-Met信号通路被激活,且c-Met磷酸化水平与Slug的表达水平存在正相关鉴于酪氨酸激酶信号通路和EMT的紧密联系,我们检测了包括EGFR、VEGFR和c-Met等若干酪氨酸激酶信号通路的活化情况,发现SKOV3/T4细胞中只有c-Met信号通路被激活,且沉默或高转Slug,可引起c-Met磷酸化水平的相应下调或上调。对115例卵巢癌临床样本的免疫组化结果表明c-Met磷酸化水平与Slug蛋白的表达存在正相关。4、转录因子Slug通过上调Fibronectin,经IntegrinαV激活c-Met信号通路Western Blot、RT-PCR实验表明SKOV3/T4细胞中HGF与c-Met的蛋白与mRNA水平与亲本相比无明显变化,Elisα实验表明SKOV3/T4细胞中HGF分泌水平与亲本相比无明显变化,即SKOV3/T4细胞中c-Met的激活具有HGF非依赖性。而siRNA沉默IntegrinαV或Fibronectin或过表达Slug质粒后沉默IntegrinαV均可最终下调c-Met的磷酸化水平。免疫荧光的实验表明过表达Slug质粒可上调Fibronectin蛋白表达。因此,我们认为转录因子Slug可通过调控Fibronectin,经由IntegrinαV激活c-Met信号通路。5、c-Met抑制剂XL184可对抗过表达Slug质粒引起的细胞运动能力的增强Western blot和划痕损伤修复实验结果表明在可有效抑制c-Met的磷酸化的浓度下,c-Met小分子抑制剂XL184可抑制过表达Slug质粒所引起的细胞运动能力的增强。6、SKOV3/T4细胞和过表达Slug质粒的SKOV3细胞对药物的敏感性下降,但对c-Met抑制剂的敏感性升高,Slug与c-Met的调控通路参与其中体外及体内动物实验结果表明SKOV3/T4细胞及过表达Slug质粒的细胞对多数化疗药物的敏感性下降,但对c-Met抑制剂的敏感性高于亲本细胞株。对八株不同组织来源的肿瘤细胞进行Slug蛋白表达水平及对c-Met抑制剂IC50的检测,结果发现两者存在负相关,且siRNA沉默IntegrinαV或Slug可部分逆转过表达Slug质粒引起的细胞药物耐受。结论:我们的研究发现,卵巢癌细胞SKOV3/T4细胞比亲本细胞SKOV3具有更高的转移潜能,并呈现上皮间质转化的生物学特征。和亲本细胞相比,SKOV3/T4细胞中的转录因子Slug的mRNA水平和蛋白水平均增加,并且转录激活Fibronectin,通过后者与IntegrinαV受体结合,以HGF非依赖的方式激活c-Met信号通路,从而增强卵巢癌细胞的迁移运动能力,同时该信号通路也参与了高转移卵巢癌细胞药物耐受情况的发生。而采用c-Met抑制剂则可降低转移能力,并且干预细胞耐药的发生,因此,干扰该信号通路中的关键分子或应用c-Met抑制剂有望成为高转移卵巢癌,尤其是Slug高表达的卵巢癌治疗中对抗转移和转移相关耐药的新策略。


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