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电磁场对不同遗传背景细胞基因组稳定性的影响研究

孙川  
【摘要】:电力和移动通信给人类生活带来了翻天覆地的变化,然而,由它们产生的电磁场(electromagnetic fields,EMFs)也相应地成为环境中增长最快的污染因素之一,其对人类健康的影响越来越受到人们的重视和关注。部分流行病学研究表明,电磁场可能与肿瘤发生相关,国际癌症研究署(International Agency for Research on Cancer,IARC)据此将工频电磁场和射频电磁场列为人类可疑致癌物。但是,由于缺乏实验室研究证据的支持,电磁场与肿瘤的关系并没有确立。DNA损伤是肿瘤发生的关键事件,因此,电磁场的遗传毒性是判断其是否具有致癌性的金标准。遗憾的是,这方面的研究结果缺乏一致性,其主要原因一方面是因为电磁场的效应比较微弱,另一方面是不同的研究采用了不同的生物学系统、电磁场暴露参数、检测方法等。为了解决这一问题,我们实验室曾在相同的实验条件下研究了电磁场对不同种类细胞DNA损伤的影响,发现效应存在差异;进一步的研究显示,射频电磁场虽然能够导致部分细胞DNA双链断裂早期标志物γH2AX焦点形成增加,但并未产生显著的DNA片段化,不仅说明其对细胞DNA的影响具有细胞种类依赖性,而且提示由它引发的DNA损伤能够被快速修复。由于不同种类细胞具有不同的遗传背景,我们认为遗传背景的不同可能是电磁场遗传毒性效应差异性的原因之一;同时,由于正常细胞能够快速修复电磁场引发的DNA损伤,我们推测DNA损伤修复缺陷的细胞可能会对电磁场更加敏感。本学位论文针对这两个问题,通过检测DNA单、双链断裂损伤的彗星实验和检测早期DNA双链断裂损伤的yH2AX焦点形成实验研究了 50 Hz工频(extremely low frequency,ELF)和 1800 MHz 射频(radio frequency,RF)电磁场对来源于同种组织的、但遗传背景不同的同类细胞,以及对野生型和遗传缺陷型细胞DNA损伤的影响,并进一步分析了其后续对细胞周期和活力的影响。1 50 Hz或1800 MHz电磁场对人胎盘绒癌细胞JAR和JEG-3基因组稳定性的影响。JAR和JEG-3都是源自人胎盘滋养层的细胞株,但来源于不同的个体,其遗传背景不同。工频电磁场效应研究碱性彗星实验结果显示,与假暴露组相比,JAR细胞内DNA片段化水平经2.0 mT 50 Hz工频电磁场暴露1或12小时后没有显著变化(暴露组Olive尾矩/假暴露组Olive尾矩平均值:1小时组,0.91 ± 0.18,P0.05;12小时组,0.92 ± 0.25,P0.05)(下同),经暴露24或36小时后显著升高(24小时组:1.34 ± 0.14,P0.05;36小时组:1.67 ± 0.40,P0.05);在同样的条件下,与假暴露组相比,JEG-3细胞内DNA片段化水平经工频电磁场暴露1小时后显著降低(0.48 ± 0.08,P0.05),但经暴露12、24或36小时后均没有显著变化(依次为1.14 ± 0.23、1.24 ±0.14 和 1.36 ± 0.19,P0.05)。γH2AX焦点形成实验结果显示,与假暴露组相比,JAR细胞内γH2AX焦点形成经2.0 mT 50 Hz工频电磁场暴露1或24小时后均没有显著变化(平均焦点数:1小时组,假暴露组6.85 ±0.40与暴露组6.82 ±0.64,P0.05;24小时组,假暴露组7.42 ± 0.50与暴露组7.24 ± 0.57,P0.05)(下同);在相同的条件下,与假暴露组相比,JEG-3细胞内yH2AX焦点形成经工频电磁场暴露1或24小时后也均没有显著变化(1小时组:5.63 ± 0.43与5.51 ± 0.54,P0.05;24小时组:6.75 ± 0.16 与 7.34 ± 0.41,P0.05)。射频电磁场效应研究碱性彗星实验结果显示,与假暴露组相比,JAR细胞内DNA片段化水平经4.0 W/kg 1800 MHz射频电磁场暴露1小时后显著降低(暴露组Olive尾矩/假暴露组Olive尾矩平均值:0.70 ±0.07,P0.05)(下同),经暴露24小时后却没有显著变化(1.10±0.17,P0.05);在相同的条件下,与假暴露组相比,JEG-3细胞内DNA片段化水平经射频电磁场暴露1小时后没有显著变化(0.96 ± 0.15,P0.05),但经暴露24小时后则显著升高(1.49 ±0.13,P0.05)。γH2AX焦点形成实验结果显示,JAR细胞内γH2AX焦点形成经射频电磁场暴露1小时后没有显著变化(平均焦点数:假暴露组7.45 ± 0.31与暴露组7.74 ± 1.27,P0.05)(下同),但经暴露24小时后显著下降(9.25 ± 0.34与7.15 ± 0.30,P0.05);在相同的条件下,与假暴露组相比,JEG-3细胞内γH2AX焦点形成经射频电磁场暴露1小时后没有显著变化(5.50 ±0.60与4.52 ±0.38,P0.05),但经暴露24小时后显著增加(4.17 ±0.38与6.28 ±0.53,P0.05)。基于以上的结果,我们进一步观察了电磁场对细胞DNA损伤是否会改变细胞的周期与活力。实验结果显示,与假暴露组相比,JAR经工频电磁场暴露24小时后,处于G2/M期的细胞比例显著升高,再培养24小时后,细胞活力显著下降;在相同的条件下,与假暴露组相比,JEG-3经工频电磁场暴露24小时后,细胞周期分布没有显著变化,活力也未发生显著改变。本部分研究结果表明,在我们的实验条件下,工频电磁场能导致JAR细胞发生DNA单链断裂损伤,并导致G2/M阻滞和细胞活力下降,但对JEG-3细胞没有显著影响;射频电磁场能减少JAR细胞内本底DNA单、双链断裂损伤水平,却导致JEG-3细胞DNA单、双链断裂损伤增加。2 50 Hz或1800 MHz电磁场暴露对野生型和毛细血管扩张共济失调突变基因(Ataxia telangecta siamutated,Atm)缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞基因组稳定性的影响。ATM激酶是磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases,PI3KK)超家族中一员,在细胞DNA损伤修复过程中起着非常重要的作用。一般认为,ATM缺失将导致细胞内DNA易形成内源性或外源性损伤,是研究弱环境因素遗传毒性的良好模型。在本部分实验中,我们采用野生型(Atm~(+/+))和Atm缺陷型(Atm~(-/-))小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEF)为模型,探索电磁场对细胞DNA的影响。工频电磁场效应研究碱性彗星实验结果显示,与假暴露组相比,Atm~(+/+)MEF细胞内DNA片段化水平经2.0 mT 50 Hz工频电磁场暴露1小时后没有显著变化(Olive尾矩:假暴露组2.43 ±0.32与暴露组2.85 ±0.61,P0.05)(下同),经暴露24小时后也未见显著性变化(2.35 ± 0.39与2.34 ±0.21,P0.05);在相同的条件下,与假暴露组相比,Atm~(-/-)MEF细胞内DNA片段化水平经工频电磁场暴露1小时后没有显著变化(8.08 ± 0.92与7.38 ± 0.76,P0.05),经暴露24小时后也未见显著性改变(8.89± 0.97 与 8.42 ± 1.08,P0.05)。γH2AX焦点形成实验结果显示,与假暴露组相比,Atm~(+/+) MEF细胞内γH2AX焦点形成经工频电磁场暴露1小时后没有显著变化(平均焦点数:假暴露组7.49 ±0.41与暴露组6.72 ±0.34,P0.05)(下同),经暴露24小时后也未见显著性改变(7.49 ±0.46与7.34 ±0.56,P0.05);在相同的条件下,与假暴露组相比,Atm~(-/-)MEF细胞内γH2AX焦点形成经工频电磁场暴露1小时后没有显著变化,经暴露24小时后也未见显著性变化(1小时:2.76 ± 0.18与2.85 ± 0.22,P0.05;24 小时:2.73 ± 0.25 与 2.82 ± 0.36,P0.05)。我们进一步观察了电磁场在未导致细胞DNA发生损伤的情况下是否影响细胞的周期与活力。实验结果显示,与假暴露组相比,Atrm~(+/+)和Atm~(-/-)MEF的细胞周期和细胞活力经工频电磁场暴露24小时后均未见显著性改变。射频电磁场效应研究碱性彗星实验结果显示,与假暴露组相比,Atm~(+/+)MEF细胞内DNA片段化水平经4.0 W/kg 1800 MHz射频电磁场暴露1小时后显著升高(Olive尾矩:假暴露组0.40 ±0.06与暴露组1.56 ±0.35,P0.05)(下同),经暴露12或24小时后则没有显著变化(12小时:1.10 ± 0.19与1.16 ± 0.17,P0.05;24小时:2.24 ±0.26与2.36 ±0.31,P0.05),经暴露36小时后反而显著下降(2.00 ±0.23与0.44 ±0.09,P0.05);在相同的条件下,与假暴露组相比,Atm~(-/-)MEF细胞内DNA片段化水平经射频电磁场暴露1小时后没有显著变化(1.12 ± 0.24与0.80 ±0.21,P0.05),经暴露12小时后则显著上升(0.78 ± 0.10与1.72 ± 0.26,P0.05),经暴露24或36小时后显著下降(24小时:2.81 ± 0.38与1.26 ± 0.19,P0.05;36小时:4.22 ±0.58与2.13 ±0.34.P0.05)。以上结果表明.射频电磁炀暴露导致两种细胞中出现DNA断裂先上升然后下降至低于本底水平的异常现象。为区分上述结果中是否存在DNA双链断裂,我们进一步采用中性彗星实验检测了细胞内DNA的片段化水平。实验结果显示,与假暴露组相比,At加+/+MEF细胞内DNA片段化水平经射频电磁场暴露1-36小后均没有显著变化;在相同的条件下,与假暴露组相比,Atm~(-/-)MEF细胞内DNA片段化水平经射频电磁场暴露1小时后没有显著变化,经暴露12或24小时后显著升高,经暴露36小时后反而显著下降。以上结果说明,射频电磁场可以导致Atm~(-/-)MEF细胞内DNA发生双链断裂,且也存在先上升然后下降至低于本底水平的现象。为明确细胞内DNA修复机制是否被激活,我们通过Western Blotting实验检测了细胞内DNA单链损伤修复标志物X射线交叉互补修复基因(X-rayrepair cross-complementing protein 1,XRCC1)表达水平及其磷酸化水平的变化。实验结果显示,与假暴露组相比,Atm~(+/+)MEF细胞内XRCC1表达水平经射频电磁场暴露1小时后显著升高,同时其磷酸化水平也显著升高;经暴露12小时后,其表达水平显著下降,但磷酸化水平则未见显著变化;经暴露24小时后,其表达水平以及磷酸化水平均没有显著变化;经暴露36小时后,其表达水平没有显著变化,但其磷酸化水平显著下降。在相同的条件下,与假暴露组相比,Atm~(-/-)MEF细胞内XRCC1表达水平经射频电磁场暴露1小时后没有显著变化,但其磷酸化水平显著升高;经暴露12小时后,其表达水平以及其磷酸化水平均显著升高;经暴露24小时后,其表达水平显著下降,但其磷酸化水平没有显著变化;经暴露36小时后,其表达水平和磷酸化水平均未见显著变化。以上结果说明,射频电磁场不仅导致Atm~(+/+)和Atm~(-/-)MEFDNA发生单链断裂损伤,而且同时激活了细胞内的DNA单链损伤修复机制。γH2AX焦点形成是细胞启动DNA双链断裂修复的早期标志物。我们的实验结果显示,与假暴露组相比,Atm~(+/+)MEF细胞内γH2AX焦点形成经射频电磁场暴露1-36小时后均没有显著变化(假暴露组与暴露组的平均焦点数:1小时,7.23± 0.44 与 8.01 ± 0.38,P0.05;12 小时,8.84 ± 0.81 与 7.42 ± 0.51,P0.05;24 小时,6.46 ± 0.57 与 7.39 ± 0.48,P0.05;36 小时,12.68 ± 0.62 与 11.21 ±0.46,P0.05)(下同);在相同的条件下,与假暴露组相比,Atm~(-/-)MEF细胞内γH2AX焦点形成经射频电磁场暴露1小时后没有显著变化(5.21 ± 0.30与5.49 ±0.25,P0.05),经暴露 12 小时后显著增加(3.98 ± 0.38 与 5.14 ± 0.33,P0.05),经暴露24或36小时后又未见显著变化(24小时:3.35 ± 0.39与3.89 ± 0.30,P0.05;24 小时:7.13 ± 0.39 与 7.41 ± 0.49,P0.05)。以上实验结果说明,Atm~(+/+)MEF细胞内确实没有产生明显的双链断裂,而Atm~(-/-)MEF中的双链断裂激活了相应的修复机制。我们进一步观察了射频电磁场对细胞DNA的损伤是否影响细胞的周期与活力。实验结果显示,与假暴露组相比,Atm~(+/+)和Atm~(-/-)MEF经射频电磁场暴露1-36小时后,其细胞活力与细胞周期均未见显著性改变。本部分的研究结果表明,工频电磁场对Atm~(+/+)和Atm~(-/-)MEF DNA损伤没有显著影响;射频电磁场则导致Atm~(+/+)和Atm~(-/-)MEF均发生DNA单链断裂损伤,但只在Atm~(-/-)MEF中产生DNA双链断裂损伤;随着暴露时间的延长,这些损伤不仅均被修复,而且导致细胞内DNA损伤水平低于假暴露组的本底值。以上结果说明:1)同一种细胞对不同种类电磁场响应是不一样的;2)DNA修复缺陷能导致细胞对射频电磁场更加敏感;3)射频电磁场所导致的DNA损伤能够被修复,并且没有明显的后续效应。毒理学研究发现,不少毒性物质具有毒物兴奋效应(hormesis)。为了能更好地理解本论文观察到的射频电磁场的独特遗传效应,我们将之与传统的致DNA损伤化学物质进行了比较。通过不断降低剂量,我们发现0.005 μM的4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline1-oxide,4NQO)或10-50μM的双氧水(H_2O_2)对MEF细胞DNA损伤的效应类似于与在本文中观察到的射频电磁场的效应。结论根据以上研究结果,我们得出如下结论:1)工频电磁场或射频电磁场对不同遗传背景的人胎盘绒癌细胞以及野生型和DNA损伤修复缺陷性MEF的遗传毒性存在差异。结合我们实验室的系列研究结果,我们得出"同一频率电磁场对不同种类细胞的效应可以不一样,同种细胞对不同种类电磁场的响应也可以是不一样"的结论;2)JAR不仅响应工频电磁场的刺激,而且出现明确的损伤效应,即导致该细胞G2/M阻滞和细胞活力下降,可能是研究工频电磁场效应机制的良好模型。3)射频电磁场能够导致Atm~(-/-)MEF发生DNA双链断裂损伤,而对Atm~(+/+)MEF却没有该效应,说明DNA修复缺陷的细胞对射频电磁场较野生型更加敏感;4)射频电磁场对Atm~(+/+)和Atm~(-/-)MEFDNA损伤均呈现出先增加后减少的效应,一方面提示射频电磁场导致的DNA损伤能够被修复,另一方面提示射频电磁场可能具有毒物兴奋样效应。本学位论文主要创新点本论文在研究思路方面进行了创新,首次探索了电磁场对来自不同个体的人胎盘滋养层细胞和DNA双链断裂修复缺陷MEF细胞的遗传毒性效应,并发现:1)在相同的条件下,同一种不同遗传背景的细胞对电磁场的响应存在差异;2)Atm~(-/-)MEF细胞对射频电磁场的响应较野生型更加敏感;3)射频电磁场对细胞DNA损伤呈现出先升高后降低的毒物兴奋效应样现象。由此,我们率先提出电磁场可能具有毒物兴奋样效应的概念。


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