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磷霉素单用及联合对产KPC酶肺炎克雷伯菌的PK/PD和基因组学研究

喻玮  
【摘要】:研究背景和目的近年来,肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年上升趋势,给临床感染治疗带来了严峻的挑战。为解决临床治疗药物有限的难题,"老药新用"备受关注。磷霉素作为"老药"代表,具有抗菌谱广、组织渗透性高、安全性良好等特点,且多项研究也证实其对多重耐药菌也具有良好的抗菌活性。然而,磷霉素单药临床治疗效果不确定且会产生快速的耐药现象,因此研究如何合理使用磷霉素治疗多重耐药细菌感染具有十分重要的临床价值。本论文主要通过评价磷霉素单用以及与亚胺培南、厄他培南、替加环素、多粘菌素E和阿米卡星联合用药对产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的体外杀菌效果,并进行药物代谢动力学和药效学评估,从中筛选出最优给药方案,以期为临床应用磷霉素治疗多重耐药菌感染提供参考。方法1.收集来自北京和浙江两家三甲医院排除痰液标本的临床感染非重复的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌170株。产碳青霉烯酶表型确证试验阳性的菌株纳入本研究,使用PCR方法检测碳青霉烯酶基因;体外药敏试验检测其对24种抗菌药物的敏感性;多位点序列分型(MLST)方法分析其克隆相关性。2.对136株菌采用体外棋盘法评估磷霉素与亚胺培南、厄他培南、替加环素、多粘菌素E和阿米卡星的协同效果。进行时间-杀菌曲线试验明确磷霉素的杀菌方式以及磷霉素与其他5种抗菌药物单用及联合用药的杀菌活性。最后通过时间-杀菌曲线筛选出杀菌效果较好的联合方案,进行不同给药剂量的PASS-400血药浓度自动模拟实验,通过计算不同的药效参数评估给药方案的抗菌效果。3.将时间-杀菌曲线试验与基因组研究相结合,从磷霉素的时间-杀菌曲线试验中,于不同浓度不同时间点取菌进行全基因组测序,利用比较基因组学分析磷霉素在动态给药过程中药物敏感性变化的机制。结果1.170株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中,有136株产碳青霉烯酶表型确证试验阳性,且均携带blaaKPC-2基因,其中有2株菌同时携带两种碳青霉烯酶基因,一株携带blaKPC-2和blaIMP-4基因,另一株携带blaKPC-2和blaIMP-8基因。这些菌株对所测抗菌药物的药敏结果显示有83株为多重耐药菌,53株为广泛耐药菌。MLST分型发现18种不同的ST型,6种新的型别提交pasteur数据库。所有菌株中,有108株(79.4%)为ST11,9株(6.6%)为ST15,其余16种序列型流行率均低于1.5%,提示存在院内克隆传播现象。2.棋盘法试验结果显示磷霉素与其他5种药物联合以相加作用为主。其中与碳青霉烯类药物联合的协同率较高,FM/IMP、FM/ETP的协同作用分别占15.44%和22.06%,其中,对磷霉素敏感的菌株,协同率有所增加(20.69%和34.48%)。时间-杀菌曲线试验确定磷霉素对肺炎克雷伯菌的杀菌方式呈浓度依赖性。基于MIC和血药浓度的时间-杀菌曲线试验提示磷霉素1×MIC和替加环素(1 mg/L和1×MIC)单药无明显的杀菌作用;亚胺培南和厄他培南单药1×MIC浓度在2小时可使细菌量下降1log10CFU/mL。多粘菌素E单药1×MIC在1h可引起3 log10CFU/mL细菌数量下降,然而4h后出现明显的细菌再生。阿米卡星单药1×MIC在12h时仍有明显的杀菌作用。联合给药方案中,FM/COL和FM/AMK有明显的协同作用,两药联合后,明显延长抗菌时间,增强杀菌作用,且随着磷霉素浓度的增加,两药联合的杀菌量也增大。进一步PASS-400血药浓度自动模拟实验结果提示FM/AMK和FM/COL的联合给药效果优于单药。对于敏感菌株,磷霉素(8g每8小时一次)/阿米卡星(15mg/kg每日一次)和磷霉素(8g每8小时一次)/多粘菌素E(2.5mg/kg每12小时一次)给药方案的杀菌与恢复生长曲线与空白对照曲线的面积差(IE)比单药高,分别为170和200 LogCFU/mL·h-1。3.通过比较基因组学发现磷霉素不同浓度不同给药时间点的基因组差异率5%,耐药基因分析发现磷霉素单药4×MIC浓度4小时和8×MIC浓度12小时较其他时间点和空白对照多注释出一个抗菌药物水解酶。另外发现,磷霉素单药32×MIC浓度6小时和12小时的两个样本中,在uhpT基因上游出现一个短片段uhpT基因的重复序列。结论本研究通过对136株产KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病学和抗菌效果研究发现:产KPC酶肺炎克雷伯菌存在院内克隆传播,具有多重耐药特点。磷霉素对肺炎克雷伯菌呈浓度依赖性杀菌方式。UhpT转运体在导致磷霉素敏感性变化中起重要作用。磷霉素与亚胺培南、厄他培南、替加环素、多粘菌素E、阿米卡星联合的杀菌效果优于单药,其中,磷霉素(8g每8小时一次)与多粘菌素E(2.5mg/kg每12小时一次)或阿米卡星(15 mg/kg每日一次)联合的抗菌活性最佳。


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