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乳酸杆菌制剂对脓毒症小鼠的保护作用及其肠道微生态与血清、粪便代谢组学研究

陈路芳  
【摘要】:研究背景:脓毒症及其并发症是重症监护病房(ICU)患者常见死亡原因之一。老年患者因免疫力低下、器官功能减退,发生脓毒症后的预后更不容乐观。研究显示,脓毒症患者常伴随肠道微生态失衡。而脓毒症所致肠上皮细胞功能紊乱、肠道菌群失调引起的致病菌过度生长及肠菌易位又将进一步加重脓毒症的发展。益生菌乳酸杆菌,通过平衡肠道菌群、调节肠道屏障功能以及增强宿主免疫对宿主起保护作用。临床研究表明乳酸菌菌株、测试剂量、摄入方式等因素不同对疾病(例如:腹泻、过敏性疾病、炎症性肠病等)的疗效有很大影响。此外,多数研究的重点仅在于评价乳酸杆菌对疾病的防治效果,少有尝试解释这些微生物益生作用的精确机制。本研究旨在探讨鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)制剂对小鼠脓毒症发生发展的影响,并从乳酸杆菌对肠道屏障功能、肠道菌群及代谢调节的影响三个方面阐述可能的机制。为益生菌能否作为脓毒症患者常规治疗用药之一提供详实的临床前研究数据。第一部分乳酸杆菌制剂对脓毒症小鼠保护作用的研究目的:观察LGG对脓毒症小鼠生存率、细胞炎症因子、肠菌易位、肠病理学改变等的影响,探讨LGG是否对脓毒症所致肠道屏障功能损伤具有保护作用。方法:采用盲肠结扎穿刺(Cecal ligation and puncture,CLP)手术构建小鼠脓毒症模型,于造模前分别给予LGG+脓毒症组小鼠LGG溶液(高、中、低剂量组),对照脓毒症与假手术组小鼠生理盐水连续灌胃4周,观察其一般情况和7天生存率。以提高生存率最为显著的LGG剂量作为后续实验剂量,于术后24h分别检测小鼠血清Alb、CRP水平;Elisa检测血清炎症因子IL-22、IL-2、TNF-α、IL-6含量;外周血培养检测菌血症情况;对小鼠结肠组织进行HE染色观察肠壁破坏情况;Ki67免疫组化、TUNEL染色分别检测结肠壁细胞增殖、凋亡情况;Occludin蛋白免疫组化检测结肠上皮细胞紧密连接状态。结果:(1)LGG治疗可显著提高脓毒症组小鼠生存率,且与剂量正相关。(2)LGG治疗升高血清Alb,降低CRP水平。同时明显降低血清炎症因子IL-22、IL-2水平,但对TNF-α与IL-6影响不大。(3)LGG治疗显著减轻脓毒症小鼠菌血症程度;明显改善肠上皮病理形态;增强肠上皮完整性;减少肠上皮炎症细胞浸润;促进肠上皮细胞增殖、抑制凋亡;并提高肠上皮细胞紧密连接相关蛋白的表达。结论:早期使用LGG通过减轻脓毒症小鼠体内炎症程度,增强肠粘膜屏障完整性与功能,减少肠菌易位降低脓毒症死亡率。第二部分乳酸杆菌制剂对脓毒症小鼠肠道微生态的影响目的:探讨LGG对脓毒症肠道微生态的影响,并分析小鼠患脓毒症后肠道微生态结构转变的特征,为将肠道微生态作为脓毒症的生物标志物提供理论依据。方法:将小鼠随机分为:LGG+脓毒症组、对照脓毒症组和假手术组,重复同前灌胃与CLP手术,术后24h分别取各组小鼠的粪便,通过16SrDNA高通量测序技术分析肠道微生态多样性,鉴定与比较不同处理组小鼠肠道菌群的组成及含量差异。结果:(1)LGG治疗显著提高脓毒症小鼠肠菌丰度及多样性。(2)PCoA结果显示三组小鼠的肠道菌群结构具有显著差异。脓毒症小鼠肠道内与能量消耗相关的拟杆菌门细菌;与机会感染相关的变形菌门、葡萄球菌科和肠球菌科细菌;与产LPS相关的致病菌肠杆菌科细菌及兼性厌氧菌如拟杆菌科、Erysipelotrichaceae科细菌比例增加,与能量储存相关的厚壁门细菌;与维持消化道屏障功能相关的阿克曼菌属细菌;与保护肝功能相关的粪球菌属、颤螺菌属细菌和专性厌氧菌如普雷沃氏菌科细菌比例降低。这些菌群结构改变打破能量平衡、加重炎症反应、降低肠道屏障功能、促进肠菌易位。LGG干预增加有益菌、降低有害菌比例,使肠道菌群结构正常化。结论:LGG早期干预,将使脓毒症失衡的肠道微生态重新趋于平衡,对肠道菌群多样性和有益菌表达均有良性调节作用。其中,阿克曼菌、普雷沃氏菌可作为治疗脓毒症的潜在益生菌开发,研究结果为以调节肠道菌群为治疗手段治疗脓毒症提供理论依据。第三部分乳酸杆菌制剂对脓毒症小鼠血清、粪便代谢组学的影响目的:在代谢水平上对脓毒症与肠道菌群关系进行深入探索,并分析LGG对脓毒症代谢的影响。方法:小鼠分组与脓毒症造模同第二部分,采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)分别检测不同处理组小鼠血清及粪便代谢谱,寻找可作为早期诊断脓毒症发生及评价LGG早期疗效的生物标志物。结果:(1)采用偏最小二乘法判别分析对三组UPLC/MS数据进行代谢模式分析,结果显示LGG+脓毒症、对照脓毒症和假手术组小鼠代谢谱显著不同,其中,LGG+脓毒症与假手术组的距离更为接近。(2)脓毒症小鼠血清中,磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholines,PCs)表达上调。含多不饱和脂肪酸的溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholines,LPCs)表达下调,含饱和脂肪酸的LPCs表达与假手术组小鼠无显著差别。19个血清标志物水平在LGG+脓毒症与假手术组小鼠间的差别小于对照组脓毒症与假手术组小鼠。LPCs、花生四烯酸、视黄醇磷酸和二磷脂酰甘油在对照脓毒症小鼠粪便中表达显著上调,L-苯丙氨酸片段和部分胆酸明显下调。LGG预处理后,多数粪便代谢物异常消失。结论:LGG对脓毒症小鼠血清及粪便中关键代谢物具有良性调节作用,主要包括脂类/磷脂代谢与胆汁酸代谢途径相关代谢产物,这些代谢途径与能量消耗、炎症反应、氧化应激等相关,肠道菌群失调与粪便代谢型异常密切相关。LGG能够通过重新平衡肠道微生态,使脓毒症小鼠的血清与粪便代谢型正常化。


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