收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

紫外诱导圆锥铁线莲中吲哚生物碱合成机理研究及CtIPT的克隆与原核表达分析

高翠霞  
【摘要】:中国是药用植物资源最丰富的国家之一,而药用植物在人类疾病预防和治疗中占有重要地位。UV-B对药用植物的生长发育和次生代谢影响很大,但是,不同药用植物对UV-B的具体响应情况有所不同,许多机理有待进一步发现。吲哚生物碱是药用植物中非常具有研究价值的一类次生代谢产物,在UV-B逆境下含量增加,不仅能够增强植物自我保护能力以抵御逆境胁迫,还具有细胞毒性、抗癌、抗病毒、抗疟和抗炎等功效,能够直接增加植物的药用价值。细胞分裂素是由腺苷酸异戊烯基转移酶合成的一类植物激素,在UV-B逆境下含量减少,不仅能够调控药用植物生长发育使其形态学发生改变而处于抵御逆境胁迫的状态,还可能与UVR8信号通路中的某些调控因子相关,参与调控植物次生代谢产物的合成(如吲哚生物碱、香豆素、黄酮等),能够间接增加植物的药用价值。圆锥铁线莲属于毛茛科,具有非常高的药用价值。实验室前期从圆锥铁线莲中分离出了吲哚生物碱(6-hydroxyl-1H-indol-3-yl)carboxylic acid methyl ester,本课题在该研究成果的基础上进行了更深入的研究,主要研究内容和结果如下:(1)圆锥铁线莲中吲哚生物碱响应UV-B诱导的合成机理HPLC-TOF-MS/MS分析显示圆锥铁线莲经过UV-B诱导后其吲哚生物碱(6-hydroxyl-1H-indol-3-yl)carboxylic acid methyl ester 含量增加,表明圆锥铁线莲在UV-B诱导下体内吲哚生物碱合成途径呈增强状态。基于2-DE和GC-TOF-MS技术的蛋白质组学和代谢组学研究揭示了圆锥铁线莲经UV-B诱导后吲哚生物碱的合成机理,即与氨基酸代谢相关的蛋白和化合物含量显著增加,表明氨基酸代谢被激活。通过对丝氨酸脱氨酶进行酶活检测,结果显示该酶活经过UV-B诱导后显著增强,表明氨基酸代谢过程被UV-B辐射激活能够促进下游莽草酸代谢途径的增强。基于qRT-PCR技术的转录组学研究分析了圆锥铁线莲经UV-B诱导后吲哚生物碱合成途径上关键基因的变化情况,结果显示从莽草酸到色氨酸代谢过程中的8个关键基因的表达表现出上调共性;通过HPLC-TOF-MS/MS代谢组检测圆锥铁线莲经UV-B诱导后吲哚生物碱合成途径上关键化合物的变化情况,结果显示邻氨基苯甲酸盐、吲哚和色氨酸的含量都增加;通过对色氨酸合成酶进行酶活检测,结果显示该酶活经过UV-B诱导后显著增强,上述结果均表明增强了的莽草酸代谢途径能够促进吲哚生物合成途径的增强,最终为吲哚生物碱的合成奠定了基础。(2)圆锥铁线莲中腺苷酸异戊烯基转移酶的克隆与原核表达借助转录组测序,我们获得了圆锥铁线莲叶片中腺苷酸异戊烯基转移酶的EST片段,之后利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE),得到了长度为1374 bp的碱基序列,其中包括长度为332 aa的完整ORF区。接着对该序列编码的蛋白CtIPT进行理化性质预测、序列比对和系统进化树分析,结果显示该蛋白是一个分子量为37.2 kDa的亲水性蛋白,存在腺苷酸异戊烯基转移酶特征序列区域(ATP/GTP结合序列区域),且与番茄中的S1IPT3/4和拟南芥中的AtIPT3/5/7非常相似,表明该蛋白为腺苷酸异戊烯基转移酶。然后通过qRT-PCR检测UV-B诱导对CtIPT表达的影响,结果显示具有显著性抑制作用,表明CtIPT可能具有抵御紫外逆境胁迫的功能。再分别以pET-28a(+)、pGEX-4T-1和pMAL-c2X质粒为表达载体对CtIPT进行克隆,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达,SDS-PAGE结果显示在16℃,180rpm,0.5mM IPTG诱导表达6 h的条件下均可以成功表达出目的蛋白,但是只有在BL21-pMAL-c2X-CtIPT(含MBP标签)中实现了可溶性表达。最后通过Amylose resin亲和层析柱进行分离纯化,得到了目的蛋白腺苷酸异戊烯基转移酶。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 朱遐;;针叶树微繁殖体发根[J];生物技术通报;1990年09期
2 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 贾彦兴;;几种吲哚生物碱的全合成研究[A];天然产物全合成—青年学术研讨会论文摘要[C];2012年
2 李晓宁;冯涛;蔡祥海;刘亚平;李艳;尚建华;罗晓东;;吲哚生物碱新颖结构、活性及临床前研究[A];中药与天然药高峰论坛暨第十二届全国中药和天然药物学术研讨会论文集[C];2012年
3 胡旭佳;方岚;孔令义;郝小江;;萝芙木吲哚生物碱成分的生物活性研究进展[A];药用植物化学与中药资源可持续发展学术研讨会论文集(上)[C];2009年
4 郭伶俐;何红平;张于;郝小江;;中国狗牙花(Ervatamia chinensis)中吲哚生物碱成分研究[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年
5 职五斌;李超忠;;吲哚生物碱Subincanadine B五环骨架的构建[A];中国化学会第26届学术年会有机化学分会场论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 陈莹莹;两种药用植物成分及结构多样性吲哚生物碱的制备研究[D];云南大学;2016年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 高翠霞;紫外诱导圆锥铁线莲中吲哚生物碱合成机理研究及CtIPT的克隆与原核表达分析[D];浙江大学;2017年
2 田文海;两个吲哚生物碱的全合成研究[D];同济大学;2008年
3 刘学民;含胍基的吲哚生物碱及2-亚胺四氢咪唑类化合物的合成研究[D];吉林大学;2013年
4 谌容;萝芙木萜类吲哚生物碱合成途径上关键酶基因的克隆与功能分析[D];西南大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978