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聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质设计及蛋白质吸附机理研究

刘韬  
【摘要】:疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatography,HCIC)是一种新型抗体分离技术,其配基兼有疏水、静电、氢键等多种相互作用,具有选择性好、耐盐性高、洗脱条件温和以及价格相对低廉等特点,已有一些成功应用实例。由于配基与抗体结合力较弱,使得HCIC介质在高流速下对抗体的动态结合载量较低,而聚合物接枝的离子交换层析介质可以显著提高蛋白的吸附容量、传质速率和动态结合载量。因此本文以高效抗体分离为目标,设计并制备了两种聚合物接枝型HCIC介质,比较蛋白吸附和传质性能,分析层析过程的固相条件(聚合物接枝、配基密度、接枝密度)和液相条件(pH和添加盐)的影响,并借助逆体积排阻层析(Inverse size exclusion chromatography,ISEC)、等温滴定量热仪(Isothermal titration calorimetry,ITC)和共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)进行了微观分析,以指导新型介质设计。主要结果如下:首先以葡聚糖接枝的琼脂糖凝胶为基质,以2-巯甲基咪唑(MMI)为配基,优化了配基偶联条件,制备了不同配基密度的葡聚糖接枝MMI介质。相比非接枝MMI介质,配基密度提高了 50%左右,达到2000μmol/g。以hIgG为模型蛋白,考察了系列葡聚糖接枝MMI介质的静态吸附、吸附动力学和层析柱动态吸附性能。结果表明,在近中性pH下,葡聚糖接枝介质对蛋白的吸附容量、结合力、传质速率和动态结合载量随着配基密度增加而持续增加,葡聚糖接枝MMI介质相比非接枝MMI介质具有更高的蛋白吸附容量、传质速率和动态结合载量。在pH 7.0~8.9时,饱和吸附容量保持在107.5~110.0 mg/g,受pH影响较小;在100 cm/h线性流速下hIgG动态结合载量达到38.3mg/g;在弱酸性条件下,葡聚糖接枝MMI介质的蛋白吸附容量和传质速率下降更显著,有利于蛋白解吸。此外,葡聚糖接枝MMI介质吸附能力受盐浓度的影响较小,但传质速率受盐浓度的影响较大。其次,针对葡聚糖接枝介质中HCIC配基同时存在于接枝层和基质孔道表面上的局限,利用表面引发的电子转移再生活化剂的原子转移自由基聚合反应,制备了不同接枝密度和配基密度的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)接枝MMI介质。结果表明,高接枝密度和中等配基密度的聚GMA接枝MMI介质对hIgG具有更高的饱和吸附容量和传质速率。相比葡聚糖接枝MMI介质以及商业化HCIC介质MEP HyperCel,聚GMA接枝介质对hIgG具有更高动态结合载量。hIgG动态结合载量受流速影响较小,线性流速300 cm/h下可达34.6 mg/g,且具有明显的pH依赖吸附和耐盐吸附特性。此外,考察了从混合蛋白体系(hIgG/HSA=1:4)中分离hIgG和从CHO细胞培养液中分离单克隆抗体,聚GMA接枝HCIC介质均表现出良好的抗体分离和重复使用性能,50个周期循环使用的抗体纯度和收率分别稳定在98.5~99.8%和 90.2~96.9%。最后,为了从微观尺度揭示聚合物接枝MMI介质的吸附及传质机制,利用ISEC考察了介质孔结构的影响,利用ITC研究了不同蛋白(hIgG和BSA)的吸附热,利用CLSM实时观测了单个介质颗粒内蛋白的吸附、传质及洗脱过程。ISEC结果表明,不加盐时葡聚糖接枝链和聚GMA接枝链在基质表面形成三维空间分布,有助于提高蛋白吸附容量;高盐浓度下,接枝链出现塌缩,且葡聚糖链的塌缩程度更明显,削弱了链传递效应,降低了蛋白传质速率。ITC结果表明,对于hIgG,在pH 8时,配基密度和盐浓度的增加会显著增加葡聚糖接枝MMI介质吸附hIgG的焓变和熵变,说明疏水相互作用增强;弱酸条件下,焓变和熵变急剧下降为负值,说明静电排斥作用主导了蛋白的解吸;对于BSA,吸附容量随着盐浓度的增加而显著下降,且焓变和熵变值为负,表明主要通过静电吸引力吸附BSA。CLSM结果表明,hIgG和BSA在葡聚糖接枝、聚GMA接枝和非接枝MMI介质内,均体现出均质扩散控制的传质机理;hIgG在高配基密度葡聚糖接枝和中等配基密度聚GMA接枝MMI介质内体现了更高的荧光强度;相比hIgG,BSA达到MMI介质内核所需时间更短;pH4.0时,中等配基密度聚GMA接枝MMI介质内的荧光强度下降最为明显;以上结果与宏观吸附、传质及分离性能相匹配。本文从提高HCIC介质的蛋白载量出发,制备了两种新型聚合物接枝HCIC介质,探讨了聚合物接枝、配基密度、接枝密度、pH、添加盐和蛋白性质对聚合物接枝HCIC介质吸附和传质性能的影响,并利用ISEC、ITC、CLSM等手段从微观角度揭示了蛋白吸附和传质机理,结果显示孔内接枝可以明显提高HCIC介质对抗体的吸附容量、传质速率及动态载量,显示出良好的抗体分离应用前景。


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