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微生物高效生产吡咯喹啉醌和聚苹果酸的研究

司振军  
【摘要】:吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)和β-聚苹果酸[poly(β-L-malic acid),PMLA]是两种具有多种不同用途的生物化学品,在食品、医药、化工等领域有广泛的应用。本文从多个角度较系统地开展了这二种重要生物化学品的高效合成机制研究及新工艺开发。论文首先对三种PQQ测定方法进行比较研究,明确了不同PQQ检测方法的特点和适用范围。利用GDH酶法检测高灵敏度特点,制备高效筛选PQQ产生菌的活性检测试纸,建立了从土壤中筛选PQQ高产菌的高通量筛选方法。在此基础上,筛选到了一株能以甲醇为唯一碳源生长的PQQ高产菌(Methlobbacillus sp.zju323),并保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),编号为M2016079,摇瓶培养结果表明PQQ产量达到25.8 mg/L。然后利用Plackett-Burman实验进行培养基优化研究。结合响应面、人工神经网络分析以及遗传算法优化,得到关键培养基组分和最佳浓度:CoC12·6H20、PABA 和 MgSO4·7H20,优化后浓度分别为 3.2 mg/L、418.7 μg/L 和 1.5 g/L。建立了 pH双阶段控制发酵策略,即发酵48 h前控制pH为6.8,之后pH为5.8,在补料发酵中前期补加甲醇,后期补加酵母粉。最后利用等离子体(ARTP)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变以及两者复合诱变育种后,利用优化后的培养基和发酵工艺补料发酵,PQQ浓度接近450.0mg/L。利用本实验室早期筛选的聚苹果酸生产菌Aurobasidium pullulans ZD-3d(CGMCC4605),开展了高产聚苹果酸新策略的研究。首先比较了葡萄糖与木薯淀粉水解液对PMLA合成的影响,结果发现生木薯淀粉水解液更有利于PMLA合成。同时研究了膜微滤和离心分离回收细胞循环发酵技术,当离心分离回收细胞循环发酵时细胞活力提高,循环发酵次数增加至5次,聚苹果酸浓度为76.2~39.6 g/L,产率0.98~1.76 gL-1h-1,得率0.78~0.86 g/g,均高于膜微滤回收细胞循环发酵。利用蛋白质组学技术研究了钙离子对聚苹果酸合成的影响。结果发现钙离子组中有458种差异蛋白,对照组中含有726种差异蛋白。对差异蛋白GO富集分析发现钙离子组中有104种膜转运蛋白,这有利于苹果酸和聚苹果酸的胞内运输和胞外分泌。本论文一方面建立了高通量筛选高产PQQ菌的方法、优化了培养条件与发酵工艺、利用诱变育种技术提高了 PQQ产量,另一方面,发展了回收细胞循环发酵合成聚苹果酸工艺技术并通过蛋白质组学技术进一步研究了聚苹果酸的合成机理,本研究对这两类化合物的高效生物合成提供了指导意义。


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