二甲双胍通过调控KLF4的表达抑制肝硬化的发生发展

【摘要】：研究背景肝硬化是慢性肝脏疾病和各种原因所导致的肝损伤的最终发展阶段。在全球范围内每年因肝硬化导致的死亡约100万,占全部死亡的2%,其中75万是由于发展为肝癌导致死亡。由于我国人口基数大且是乙肝大国,因此我国肝硬化的发病率占世界首位。同时肝硬化不仅为全球带来沉重的健康威胁也为国民经济带来沉重的负担。肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化必经的病理改变。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纤维化发生、发展的关键细胞。肝星状细胞(hepatic stellate cells.HSCs)又称贮脂细胞(fat—storing cell,FSC),分布于肝脏的Disse间隙内,是合成、分泌细胞外基质的主要来源。目前研究认为静息型HSC激活转变为活化型HSC,是肝纤维化发生的中心环节。肝硬化依旧被许多医学家认为是肝脏疾病的终末期发展阶段,除了肝移植外尚没有效的可供选择的诊疗手段。然而随着研究的深入发现肝硬化被认为是终末期肝病的发展阶段这一概念在不断地受到挑战,研究数据发现在所谓临床上定义的肝硬化仍有不同的发展阶段,且不同的阶段其预后完全不一样。因此肝硬化不同发展阶段截然不同的预后生存及其潜在的可逆转性激发了研究者探求延缓或阻止肝硬化进展的治疗策略。因此挖掘静息型和活化型肝星状细胞之间差异表达的基因对研究肝纤维化发生发展的具体机制具有深远意义。肝纤维化最终可能导致肝硬化,它是所有慢性肝脏疾病的病理基础,其特点是细胞外基质(ECM)成分特别是I型和III型胶原蛋白过度合成的不平衡而降解减少。最近研究发现二甲双胍对肾脏间质纤维化也有保护作用。因此探索二甲双胍对脏器的纤维化的逆转的具体机制为研发新型抗纤维化的药物提供了新的方向。第一部分小鼠肝纤维化相关差异表达基因的筛选目的:挖掘小鼠肝纤维化相关差异表达基因方法:收集小鼠肝纤维化造模的肝组织及对照组各5例及分离鉴定的原代小鼠肝星状细胞培养1天、培养7天及培养14天的各3例,然后委托上海伯豪生物技术有限公司进行生物样本的RNA的抽提与质检,芯片实验,数据分析。结果:以差异倍数以差异倍数≥2倍,T检验P值0.05作为筛选条件,发现小鼠肝纤维化组织与对照组相比其中高表达551个,低表达188个;小鼠肝星状细胞培养7天与培养1天相比其中高表达699个,低表达495个;小鼠肝星状细胞培养14天与培养1天相比其中高表达1784个,低表达3555个;小鼠肝星状细胞培养14天与培养7天相比其中高表达143个,低表达641个;小鼠肝星状细胞培养1天,7天,14天三者取交集其中高表达25个,低表达28个。在半活化期小鼠原代肝星状细胞,活化期小鼠原代肝星状细胞及小鼠肝纤维化组织均表达升高的基因有3个,分别为:Colla2、Fam69b、Gpbar1;在半活化期小鼠原代肝星状细胞,活化期小鼠原代肝星状细胞及小鼠肝纤维化组织均表达降低的基因有2个,分别为 Ear3、Edn1。结论:通过基因芯片筛选出调节小鼠肝纤维化的关键基因,为后续的机制研究提供了方向。第二部分二甲双胍通过上调KLF4的表达抑制肝纤维化发生发展的研究目的:探索二甲双胍抑制肝纤维化发生发展的具体作用机制方法:构建SD大鼠肝纤维化模型,设置橄榄油组、四氯化碳组、四氯化碳+二甲双胍组、四氯化碳+KLF4组,然后对每组的肝组织进行HE染色,Massion染色,KLF4免疫组化,a-SMA免疫组化,比较HE形态变化及Massion染色深浅及KLF4和a-SMA的表达阳性高低;分离培养鉴定SD大鼠原代肝星状细胞;在原代肝星状细胞及人源化的肝星状细胞中分别进行二甲双胍药物刺激及对照PBS刺激和转染过表达KLF4及对照腺病毒,WB检测KLF4及a-SMA的表达;在原代肝星状细胞及人源化的肝星状细胞中分别设置PBS组,二甲双胍组,二甲双胍+Si-KLF4组,分别WB检测KLF4及a-SMA的表达。结果:在KLF4免疫组化染色中,KLF4的表达在四氯化碳组要低于橄榄油组,四氯化碳+二甲双胍组和四氯化碳+KLF4组均高于四氯化碳组;在a-SMA免疫组化染色中,a-SMA的表达在四氯化碳组要高于橄榄油组,四氯化碳+二甲双胍组和四氯化碳+KLF4组均低于四氯化碳组;HE和Massion染色中,四氯化碳组纤维化程度要高于橄榄油组,四氯化碳+二甲双胍组和四氯化碳+KLF4组纤维化程度均低于四氯化碳组;分离培养的SD大鼠原代肝星状细胞经Desmin免疫荧光染色确定是原代肝星状细胞;在原代肝星状细胞及人源化的肝星状细胞中二甲双胍药物刺激及过表达KLF4组较PBS组及腺病毒对照组,a-SMA表达降低,KLF4表达升高;在原代肝星状细胞及人源化的肝星状细胞中,KLF4的表达二甲双胍组高于PBS组,二甲双胍+Si-KLF4组低于二甲双胍组,a-SMA的表达二甲双胍组低于PBS组,二甲双胍+Si-KLF4组高于二甲双胍组。结论:二甲双胍通过上调KLF4的表达抑制肝星状细胞的活化,从而减缓肝纤维化的发生发展。