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白菜PGIPs基因家族的进化分析及BrPGIP4与BrPGIP2功能的初步研究

曾繁欢  
【摘要】:植物PGIPs是一种位于植物细胞壁中的特异性结合蛋白,属于LRRs中的一员。植物PGIP蛋白最多含有10个LRRs保守结构域,部分略有变化。每个LRR由24个氨基酸残基构成[LxxLxxLxLxxNxLt/sgxIPxxLGx(L= I/L/V/F;N = N/T/S/C;C = C/S;x =any amino acid)],上述保守的 LRRs 结构是蛋白质间相互作用的核心功能区域,因而植物PGIP能特异性地抑制病原菌分泌的内切多聚半乳糖醛酸酶,阻止病原菌对宿主植物的侵害,起到提高植物对病原菌抗性的作用。在前人研究基础上,以及大部分重要芸薹属作物基因组测序完成之后,使得鉴定其PGIPs基因,研究PGIPs基因在芸薹属作物抗病性方面的作用成为可能。本研究鉴定了白菜PGIPs基因家族成员,分析其基因结构、染色体定位、生理生化功能、LRR保守结构域等。分析了其在白菜不同组织中的表达情况,构建了BrPGIP 和BrPGIP12的过表达载体、amiRNA表达载体,并进行了菜心的转基因实验,主要研究结果如下:(1)利用已知的拟南芥PGIPs基因的蛋白氨基酸序列,在白菜数据库和NCBI数据库中搜索白菜PGIPs基因,并利用LRRs保守结构分析进行最后鉴定,最后成功鉴定出了 12个白菜PGIPs基因,并对其进行了命名。这12个白菜PGIPs基因定位在白菜A01、A03、A05、A10染色体上,有些基因相邻成簇的排列,开放阅读框长度在618bp~1044bp之间,编码205aa~347aa个氨基酸的多肽,分子量在22.8 kD~38.6 kD之间。理论上的pl值在5.82~9.46之间。除了 1个基因外,其余都有1-3个糖基化位点,除了 3个基因外,其余亚细胞预测都定位在分泌途径中。12个白菜PGIP蛋白都含有LRRs结构域,最多含有9个,最少含有4个,LRRs结构域数量的算术平均数为7.1。研究发现白菜PGIPs基因在基因结构、motif分析以及进化分析中均表现得特别保守。依照同样的方法,对主要芸薹属作物中的甘蓝(Brassica oleracea)、甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜(B.juncea)PGIPs基因进行了鉴定和分析。(2)利用实时荧光定量PCR技术系统分析了 12个白菜PGlPs基因在白菜根、茎、叶、花、角果中的表达情况。结果表明,BrPGIP2、BrPGIP10在根、茎中表达量极低,BrPGIP12、BrPGIP11、BrPGIP9、BrPGIP1在根、茎中表达量很高:BrPGIP2、BrPGIP10、BrPGIP8、BrPGIP5在叶中的表达量极低,BrPGIP1则表达量特别高;BrPGIP8、BrPGIP5在花和角果中的表达量极低,而BrPGIP12、BrPGIP7在花果中表达量比较高。(3)序列比对分析结果显示,PGIP基因主要存在于高等植物中,在藻类及以下低等植物中并不存在。苔藓类可能是PGIP基因的起源植物之一,在植物进化的过程中发生大量的PGIP基因丢失和复制现象。植物PGIP家族成员间同源性很高,在开放阅读框长度、外显子内含子数量与分布、蛋白Motif种类与数量上较为保守。不同植物间的PGIP基因LRR保守结构域也十分保守,在植物防御反应中起到重要作用的PGlP基因通常LRR数量为5~9个。Ks分析结果显示,白菜和拟南芥PGIP基因家族的分化大约发生在1.6~1.9千万年前。(4)分别构建了 BrPGIP12和BrPGIP4过表达载体、amiRNA表达载体,并对这4个载体以及pBI121空载载体进行'油青四九'菜心的遗传转化,获得了 2个amiRNA9238转基因菜心、4个amiRNA5918转基因菜心、8个OE9238转基因菜心、3个OE5918转基因菜心、3个pBI121空载转基因菜心。利用利用实时荧光定量PCR技术分析了在5个载体转基因菜心中BrPGIP12和BrPGIP4的表达情况。BrPGIP12和BrPGIP4在过表达转基因菜心中表达量均有提高,最明显的是OE9-5和OE9-6,与CK相比BrPGIP12表达量提高了 5倍,而BrPGIP4在两个过表达转基因菜心中表达量略有提高。BrPGIP4在转BrPGIP4 amiRNA载体菜心中的表达量均成降低趋势,其中最明显的是am5-2,BrPGIP 表达量降低约一半左右。研究结果将为后续深入研究芸薹属作物PGIP基因家族成员的生物学功能提供研究基础和理论依据。


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