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快速核酸扩增及可视化策略用于食源性致病菌和转基因作物检测

王瑞  
【摘要】:核酸扩增检测技术通过对模板分子进行百万倍扩增来实现对核酸的高灵敏检测,在食品安全检测领域发挥着重要作用。但目前的核酸扩增检测技术主要局限于实验室应用,不适用于现场快速检测。本课题以食源性致病菌和转基因作物为研究对象,从核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个方面展开研究,开发了快速、简便、可视化的检测方法用于食品安全快速检测,并且开发了可视化的DNA分子计数方法对样本中的模板分子进行计数。主要研究内容及结果如下:(1)本课题采用环介导恒温扩增和基于磷酸根的可视化检测方法对加标对虾样本中的副溶血性弧菌进行快速检测。首先,采用棉签擦拭加标对虾样本进行取样;然后,采用NaOH溶液对获得的样本进行快速细胞裂解,并将细胞裂解液稀释10倍后直接作为模板进行LAMP扩增;最后采用磷酸根比色法对扩增结果进行可视化检测。结果显示,该可视化检测方法对纯培养的副溶血性弧菌的检测限为2.63×10~3 CFU/mL,对加标对虾样本中的副溶血性弧菌的检测限为3.00×10~3 CFU/g。采用传统菌落培养计数法做为标准对照,对151个对虾样本进行可视化检测。结果显示可视化检测方法对加标对虾样本的阳性检出率为94.7%(143/151),检测特异性和灵敏度分别为100%(65/65)和90.7%(78/86)。该方法可在1小时内完成从样本获取到结果输出的整个过程,避免了取样过程中的样本交叉污染问题,仅需一个简单的热块即可完成检测,在食源性致病菌的快速检测中展现出巨大应用潜力。(2)为了进一步缩短检测时间,本课题探究了一种交叉引物恒温扩增的加速剂——普鲁兰多糖。结果显示,1%(w/v)工作浓度的普鲁兰多糖对CPA扩增的加速作用最为明显,可使CPA扩增提速7 min左右,使扩增到达阈值的时间缩短三分之一。将普鲁兰多糖作为CPA扩增的加速剂并采用试纸条对扩增产物进行检测,可在20 min内完成对转基因大米DNA的检测。为了避免试纸条检测中由开盖操作引发的扩增子气溶胶污染问题,本课题开发了三种类型的密闭性、便携式、防污染试纸条装置。在核酸扩增完成后,通过简单的摇动或按压操作使反应液与试纸条接触,从而完成试纸条对扩增产物的检测。将普鲁兰多糖作为CPA扩增的加速剂并与试纸条终点检测相结合,可实现对样本的快速、高灵敏、特异性检测。开发的试纸条防污染装置使核酸扩增和检测在密闭空间内进行,从源头上避免了扩增子交叉污染问题。(3)为了进一步缩短检测时间和减少对仪器的使用,本课题开发了一种简便、快速、可视化的检测方法用于现场筛选GTS 40-3-2转基因大豆。该方法以非纯化的DNA为模板,采用体温孵育的方式进行重组酶聚合酶扩增。扩增完成后向扩增产物中加入SYBR Green I染料并对检测结果进行肉眼观察。该方法无需加热设备,仅需一个迷你紫外手电筒即可完成检测,并且从样本获取到结果输出的整个过程可在10 min内完成。该方法具有很高的检测灵敏度和特异性,并且对不同长度的引物(22~30 bp)、非纯化的DNA模板和不同的反应温度(30~40°C)展现出强健的鲁棒性。20名志愿者在不同环境温度下采用该方法对GTS40-3-2转基因大豆进行了筛选,结果显示阳性样本的检出率为100%。该体温触发的RPA扩增及可视化检测方法耗时短、灵敏度高、鲁棒性强、无需加热设备即可实现,适用于对转基因作物的现场快速筛查。(4)为了实现对DNA模板的快速计数,本课题开发了一种简便的方法,无需任何DNA分子预修饰或预分离过程,可在几分钟内通过读取扩增子荧光簇的个数得到样本中DNA分子的数目。该方法基于细柔性塑料管的快速热传导效应及扩增子在细柔性塑料管内极弱的对流和扩散效应。通过采用自主设计的自动化PCR装置将含有扩增样本的细柔性塑料管在两个不同温度的水浴间穿梭,可在5 min内完成快速PCR扩增。扩增子与预先加入体系的荧光染料结合,在紫外灯照射下呈现出明亮的荧光簇。通过用肉眼观察计数扩增子荧光簇的个数可得到每个样本中初始加入的DNA分子数目。通过分析扩增子荧光簇在细柔性塑料管中的扩散过程,我们提出了快速PCR扩增过程中的DNA分子扩增-扩散模型。该可视化DNA计数方法直接、快速、易于实现,无需借助任何微流控设备和精密光学设备,为DNA分子快速计数提供了新方法,并且为单分子检测提供了新思路。


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