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miR414和TOE1调控植物表皮毛及NbGIS调控烟草腺毛发育的功能研究

刘一华  
【摘要】:表皮毛(腺毛)是大多数陆生植物地上部分表皮常见的一种结构,形态大小各异,常作为植物物种识别的重要依据。表皮毛是植物表面的第一层防护系统,可以保护植物免受温度、干旱、紫外线和病虫害等不良外界环境影响。其中,烟草腺毛代谢产物不仅有助于植物驱逐有害病虫,吸引昆虫授粉,也可作为生产香料、化妆品、药物等的重要原材料。拟南芥表皮毛的发育调控是研究植物细胞命运分化、器官形态建成及不同发育过程相互作用的重要模型,同时可以为研究烟草和青蒿等多细胞腺毛植物的调控机制以及和表皮毛细胞发育和调控机制相似的棉花纤维细胞提供理论基础。拟南芥的表皮毛形成主要受多种转录因子、miRNAs以及植物激素的共同调控。本论文主要对拟南芥miR414和转录因子TARGET OF EARLY ACTIVATION TAGGED 1(TOE1)在调控表皮毛发育方面的功能进行研究。并利用拟南芥表皮毛的研究方法和研究成果,探究烟草腺毛的发育和调控机制,克隆了拟南芥表皮毛调控因子GIS在烟草中的同源基因NbGIS,研究其在烟草腺毛发育方面的功能。本论文的所取得主要研究成果如下;1、miR414介导GA信号途径通过靶定目标基因GL3,调控拟南芥表皮毛的发育。我们通过生物信息学分析预测GL3基因的表达可能受miR414的靶定。通过构建拟南芥miR414的过量表达载体、STTM干扰载体及启动子与GUS融合的表达载体,验证了拟南芥miR414的功能及表达模式。定量分析和表皮毛观察统计进一步证明了miR414通过抑制GL3的表达量来调控拟南芥表皮毛发育。对GA处理后拟南芥野生型、GA缺失突变体ga1-3和GA不敏感突变体gai进行表达量分析,发现miR414在GA处理后表达量显著下调,在GA突变体中的表达量显著上调。同时GL3的表达量变化趋势与miR414相反。结果证明GA信号通过抑制miR414的表达,从而释放对GL3的表达抑制信号,促进表皮毛起始。定量分析拟南芥野生型、35S:GL3转基因株系和突变体gl3中miR414的表达量,发现miR414受其预测靶基因GL3的正向调控。2、TOE1/TOE2与GIS/GIS2/ZFP8蛋白互作,作用于GL3上游,调控拟南芥表皮毛的发育。通过对拟南芥野生型,转基因株系35S:miR172b和35S:TOE1,突变体toe1、toe 2和toe1toe2的表皮毛观察和统计,发现miR172抑制主茎各部位表皮毛的产生,而TOE1/TOE2基因可以促进主茎各部位表皮毛的生长发育。这说明miR172和TOE1/TOE2参与主茎各部位表皮毛的生长发育。通过定量分析结果发现TOE1/TOE2作用于GL3上游,促进GL3的表达。通过酵母双杂实验和双分子荧光互补实验发现TOE1/TOE2分别与GIS/GIS2/ZFP8,具有直接互作关系。3、烟草NbGIS基因促进烟草腺毛的发育并影响植株的生长发育。通过组织特异性表达分析在烟草中AtGIS启动子驱动的组织表达模式,发现AtGIS启动子在烟草各组织中都有表达活性,且在烟草腺毛中表达尤为明显。通过腺毛表型观察,发现AtGIS在烟草中异位表达显著提高表皮毛数量。通过构建NbGIS的过量表达载体、RNA干扰载体,获得NbGIS转基因烟草植株。对转基因烟草表型观察统计发现,NbGIS过量表达株系植株矮小,但腺毛数量显著高于野生型;而NbGIS干扰株系植株高大,烟草腺毛数量显著低于野生型。进一步实验研究结果发现不同株系和野生型植株叶片单位面积表皮细胞数量相比没有变化,由此证明NbGIS促进烟草腺毛的分化与表皮细胞分化无关。4、NbGIS介导GA信号途径调控烟草腺毛的发育及烟草体内GA的生物合成。赤霉素处理烟草幼苗,NbGIS的表达量显著上调,外源GA处理发现野生型烟草植株腺毛数量显著提高,而NbGIS-Ri株系腺毛密度变化不显著。使用VIGS技术敲除野生型烟草的GA合成基因NbKO和NbGA200x1,与对照相比NbGIS表达量显著下调,腺毛密度降低。这些结果说明NbGIS介导GA信号途径调控烟草腺毛的发育。通过对GA合成关键基因定量分析检测不同转基因株系体内GA含量,发现NbGIS过量表达株系中NbKO和NbGA20ox1表达量和内源GA含量显著低于野生型,而NbGIS-Ri株系呈现出相反的结果,这说明NbGIS基因抑制烟草体内GA的生物合成,从而影响植株的生长发育。


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