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百合小鳞茎从头再生的组织学和转录组学研究

张琳  
【摘要】:百合是世界第二大球根花卉。利用分离鳞片进行营养繁殖是百合主要的繁殖手段,其小鳞茎再生,与模式植物分离叶片上芽器官发生为同一生物学过程,而鳞片作为变态叶,使其又具有球根花卉的特殊性。在模式植物上对芽从头再生的分子调控机制已深入,然而由于缺乏基因组信息和转基因困难,百合上对这一具有重要生产应用价值和科学研究价值的生物学过程缺乏系统研究,发生初期的组织学基础和阶段划分不甚明晰,发生初期的转录调控机制有待探索。因此,本研究选择在再生速率、再生频率和繁殖系数上有明显差异的野百合及其变种巨球百合开展比较研究,并以东方百合'索邦'为参照种质。以组织学和细胞学手段对发生关键时期和组织起源进行分析界定,通过外源生长素处理以探求创伤响应引起脱分化的小鳞茎发生的组织学基础。基于Pacbio和Illumina联合测序技术,进一步对小鳞茎发生和发育初期的关键时间点进行转录组研究,以挖掘与生长素信号响应的关键通路和候选基因。本研究为深入解析百合小鳞茎发生途径的分子机理提供了实验依据,为今后挖掘与验证鳞茎发生的关键基因与构建鳞茎发生分子调控网络奠定了基础。主要研究结果如下:1.响应创伤和2,4-D信号小鳞茎形成的阶段和组织起源界定小鳞茎再生过程包括细胞的脱分化和再分化,脱分化能力显著影响再生能力,并且决定着分化方向,因此以2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)胁迫处理以激发鳞片预胚性细胞的脱分化和胚性细胞保持。本实验鉴定出百合小鳞茎直接器官发生途径的预胚性细胞,包括以维管束木质部端类中柱鞘细胞、维管束近轴端薄壁细胞和表皮细胞,共同奠定了百合小鳞茎直接器官发生途径的组织基础,并从时间序列角度明确它们响应创伤信号的次序。淀粉粒通过活跃分裂提供能量,而并不是脱分化和分裂的主导因素。添加外源2,4-D处理后,预胚性细胞的分裂能力被极大地增强,诱导单独创伤刺激下相对静止的维管束间近轴端薄壁细胞也开始旺盛分裂。组织学和转录组学共同指出,预胚性细胞是小鳞茎器官从头发生的组织基础,而创伤信号是决定性环境诱因,2,4-D胁迫则极大促进脱分化和细胞干性维持。2.获得百合小鳞茎从头再生关键时期全长转录本数据获得三个百合种质每个15Gb的PacBio转录组测序数据,去冗余后得到的最终转录本N50为4199、5422和5199bp。三种百合在转录因子家族分类和植物抗病基因结构域的注释上具有整体相似性,也含有特异注释。对4个发生关键阶段、2,4-D处理及对照组两种处理条件、3种百合、鳞茎盘和鳞片两种组织共获得包括3个重复在内的66个样本每个样本10Gb的Illumina转录组测序数据,检测到48279、48397和57956条基因。对参考全长转录本的平均总比对率分别为71.50%、80.79%和81.85%,该全长转录本数据库将为百合,及其他缺乏基因组信息的球根植物类似的繁殖体再生研究提供重要参考。同时,对培养鳞片来源的巨球百合离体小鳞茎进行Illumina转录组测序,获得60121条unigenes,平均长度830bp,N50为1396bp,从转录本水平上进一步说明离体小鳞茎作为重要的养分贮藏器官,碳水化合物转运和代谢非常活跃。3.组织学和联合测序共同阐明了百合属的种质差异组织学观察指出,巨球百合和野百合属于小鳞茎快速发生类型的种质,而东方百合'索邦'则小鳞茎发生较慢,转录组学数据进一步印证了这一结果:快速发生种质在培养初期和后期间样本相关性较低、主成分分析样品簇距离较远,相对于鳞片剥离时的差异基因数量在8天即较大。组织学观察指出,2,4-D极大地促进了三种百合的脱分化和细胞分裂进程,但三种百合对2,4-D胁迫的耐受性不同:东方百合'索邦'巨球百合野百合。转录组学数据进一步印证了这一结果:处理条件未明显影响东方百合'索邦'鳞片和巨球百合培养初期的基因表达模式,而野百合与二者差异较大,大量基因响应创伤和2,4-D胁迫迅速上调表达。4.鉴定鳞片脱分化和器官发生关键通路和候选基因上文指出创伤响应是小鳞茎器官从头发生的主要决定因素,联合测序分析表明脱落酸信号相关、碳水化合物代谢、活性氧代谢途径是创伤信号响应的重要通路,鉴定出包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在内14条关键候选基因。2,4-D深入调控与愈伤形成、胚性细胞身份维持和干细胞群体维持相关通路,并影响碳水化合物代谢、细胞分化、线粒体途径、RNA转录和胁迫响应相关通路,鉴定出包括1,2-二羟基-3-酮-5-甲基硫戊烷双加氧酶、3'-磷酸腺苷5'-磷硫酸盐合酶、琥珀酸脱氢酶组装因子2和细胞分裂素1调节蛋白在内的39条候选基因,其中6条为关键优先候选基因。进一步地,通过权重共表达网络分析对主要差异阶段进行跨样本和处理分析,鉴定出包括核酸外切酶1、复制因子A1、G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白-B、细胞周期蛋白A、G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白-B、果胶酯酶、果胶裂解酶、组蛋白H2A、丝切蛋白、整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2C等13条对2,4-D响应的枢纽基因,调控DNA甲基化可能是2,4-D诱导细胞脱分化的机制。此外,首次指出光合作用通路是离体鳞片光照下培养的重要通路,相对于鳞茎盘特异性地在鳞片中富集。


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