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OsMsh6突变体的自发和诱发点突变的研究

吴穹宇  
【摘要】:错配修复(Mismatch Repair,MMR)系统是DNA修复的重要途径之一,负责识别和校正单碱基错配和未配对核苷酸,在生物体中高度保守,对于维护DNA复制的高保真度、高准确度和基因组稳定性至关重要。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,也是单子叶模式植物。水稻OsMsh6基因是与拟南芥AtMsh6同源的错配修复基因,但迄今为止,对其功能及其突变体对诱变处理的反应尚无报道。为此,本研究分析了OsMsh 纯合插入突变体自发与诱发点突变的发生频率与特点,并建立了简便、快速、不经测序即可确定单碱基突变的检测方法。主要结果如下:(1)OsMsh6突变体的自发点突变。利用简化基因组测序技术对OsMsh6突变体的自发点突变进行研究。从3个OsMsh6(LOC_Os09g24220)纯合插入突变体NF9010、NF7784和ND6011中检测到994个碱基突变,平均每个突变株系上的单核苷酸突变密度约为1/136.72Kb。这些点突变相对平均地分布在各条染色体上,并随着世代累积。所有可能的碱基转换和颠换的类型都能看到,且碱基转换与颠换的比例大约是3.12。突变位点侧翼的碱基组成存在偏差。这一结果表明OsMsh6基因可识别和修复自发产生的点突变,对维护基因组稳定性具有重要作用,也为进一步研究OsMsh6基因在DNA修复中的功能和探索MMR突变体在水稻诱变育种中的应用奠定了基础。(2)OsMsh6突变体的诱发点突变。以水稻OsMsh6基因插入突变体NF9010为离子束诱变处理的对象,比较了插入突变体与对照(Msh6WT)间发生点突变的频率与特点。发现OsMsh6突变体的诱发突变频率约是对照的3倍,可见以MMR缺陷体作为辐射诱变处理的起始材料,可显著提高点突变产生的效率。与自发突变的情形相同,在突变体NF9010与对照Msh6WT中所有可能的碱基转换和颠换的类型都能看到,表明二者突变谱都具有广泛性。突变体相比对照的不同之处在于,碱基转换发生的频率更高,更多的点突变集中在第8、11和12染色体等。对N+离子束诱变处理发生的突变位点侧翼的碱基也进行了检查。这一研究结果对于利用错配修复突变体构建高效的诱变育种体系具有指导意义,同时也从另一个角度证明了Msh 基因在错配修复中的重要作用。(3)点突变快速检测方法。利用CELI酶的切割特性,结合人工接头链接和特异性扩增,建立一种无需测序即可快速确定点突变有无、位置和类型的方法。本方法包括6个步骤:1)根据待测目标序列设计引物,对待测样本和参照分别进行PCR扩增;2)将两组扩增产物形成的异质双链产物,用CELI酶切;3)电泳检测酶切产物,确定待测样品是否含有单碱基突变;4)回收其中被CEL I酶切开产生的新片段,每个片段分别与带A、C、G或T粘性末端的接头连接;5)连接产物用目标片段引物和接头引物组成的联合引物进行特异性扩增;6)电泳检测,以有扩增产物的接头为依据,推断出点突变的类型。本研究所提出的检测单碱基突变的方法,无需测序能够检测已知的单碱基突变,也可以筛查未知的单碱基突变,既可以确定突变的位置,又可以确定突变的类型,为点突变的快速而又经济检测提供了一种新方法。


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