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Es-BMP2通过调控驱动蛋白KIFC1表达参与中华绒螯蟹精子发生

杨彤  
【摘要】:中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是研究十足目甲壳动物精子发生的模式物种之一。对中华绒螯蟹精子发生动力学和信号通路调控研究,有助于阐明其生殖调控机制。骨形态发生蛋白(BMPs)是转化生长因子β(TGFβ)超家族中一个重要的分支,广泛参与胚胎发育、细胞增殖、细胞分化等生理活动。本研究主要探究TGFβ超家族中BMP2在中华绒螯蟹精子发生过程中发挥的功能及其可能的分子机制。首先从中华绒螯蟹精巢组织中克隆获得编码BMP2同源蛋白的基因,中华绒螯蟹es-bmp2基因CDS长1215bp,共编码404个氨基酸。Es-BMP2包含一段跨膜结构域及TGFβ结构域。与其他物种同源序列比对分析发现,其TGFβ结构域氨基酸序列相对保守。系统进化树分析发现,其与三疣梭子蟹BMP2蛋白聚为一支。为检测Es-BMP2蛋白的表达水平和细胞水平定位情况,本研究通过原核表达Es-BMP2融合蛋白及小鼠腹腔注射抗原,制备了Es-BMP2鼠多克隆抗体。随后利用RT-PCR和Western blot技术探究了Es-BMP2在中华绒螯蟹各组织中的表达模式,并通过免疫荧光实验观察了Es-BMP2在精巢中的分布情况。结果显示,在精巢中es-bmp2 m RNA和蛋白的表达水平均相对较高,并且Es-BMP2在生殖细胞中均有表达,在成熟精子中,其信号主要聚集在顶体发生一侧。为研究Es-BMP2在中华绒螯蟹精子发生中的功能,本研究通过注射es-bmp2特异性ds RNA,成功地对中华绒螯蟹进行活体RNAi。我们对其精巢组织进行观察发现,RNAi组中成熟精子出现大量精核发育畸形,表明其可能参与中华绒螯蟹精子形成过程。为进一步对其分子机制进行探究,本研究检测了中华绒螯蟹精核形成与顶体发生中重要的马达蛋白Es-KIFC1的表达水平。结果显示,与对照组相比,es-bmp2 RNAi组精巢中,Es-KIFC1的表达水平显著降低。通过体外干扰试验,本课题进一步对上述结果进行了验证。在精巢组织原代培养的细胞转染es-bmp2 ds RNA后,Es-KIFC1的表达同样受到抑制。综上所述,我们认为Es-BMP2可能通过调节驱动蛋白Es-KIFC1的表达参与中华绒螯蟹精子发生过程。


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