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脑心肌炎病毒VP1蛋白致糖尿病相关毒力位点分析及增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建

徐超  
【摘要】:脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种人兽共患病毒,属于微RNA病毒科心病毒属,与同科的脊髓灰质炎病毒、肠道病毒71以及柯萨奇病毒一样,是通过粪口途径传播的肠道病毒之一。EMCV具有广泛的宿主嗜性,主要感染啮齿类、猪及灵长类动物,并导致脑炎、心肌炎、生殖障碍和糖尿病等多系统疾病。本研究首先构建了基于CMV启动子的EMCV反向遗传操作系统,并以此为基础构建了衣壳蛋白VP1第152位苏氨酸突变的病毒突变体,分析了该位点在EMCV致糖尿病中的功能;同时,本研究还在EMCV感染性克隆骨架的2A基因后插入增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)外源基因,构建携带EGFP的EMCV嵌合病毒,以期为该病毒的体内外研究提供有力工具。本研究首先将猪源EMCV分离株BJC3的全长基因插入含有CMV启动子的克隆载体,构建EMCV反向遗传操作系统,并通过将重组质粒转染BHK-21细胞获得EMCV野生型拯救病毒。病毒的增殖动态学试验证实拯救病毒和亲本病毒在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性,且全基因组测序结果证实拯救病毒具有遗传稳定性。随后,通过小鼠感染模型,进一步探究了拯救病毒的神经致病性及组织噬性,结果表明拯救病毒对小鼠的神经致病性虽低于野生型亲本病毒,但仍保持了良好的体内增殖能力。研究结果证实,基于CMV启动子的EMCV感染性克隆能够高效、稳定地拯救病毒,并保持了与野生型亲本病毒相似的体内外生物学特性。早期研究认为,EMC-D株基因组第776位丙基酸是决定其是否导致小鼠病毒性糖尿病的关键毒力位点;然而,此位点相关突变能否导致嗜神经型EMCV毒株的临床表征由脑炎型转为糖尿病型尚不清楚。因此,本研究将EMCV病毒基因组第776位苏基酸突变为丙氨酸,并检测了拯救病毒EMCV-T776A在胰腺细胞系上的感染和增殖特性。结果表明,与亲本病毒EMCV-RV相比,T776A突变株在BHK-21、β-TC-6等传代细胞中均表现出相似的增殖特性,说明该位点并未改变BJC3对胰腺β细胞的体外嗜性。随后,本研究以不同剂量T776A突变病毒感染C57BL/6J和ICR两种品系小鼠,分析了丙氨酸是否为EMCV导致小鼠糖尿病的决定位点。然而,结果显示T776A攻毒小鼠的血糖水平相较于PBS处理对照虽有轻微上升,但并未达到糖尿病的判定标准,暗示该氨基酸位点并不增强嗜神经型EMCV毒株对胰腺细胞的体内嗜性。携带EGFP的EMCV嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的CMV感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得了携带EGFP的嵌合病毒。本研究通过real-time PCR、IFA及TCID50等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行了测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP基因的插入对EMCV病毒粒子的组装释放具有不良影响,并在传代过程中逐渐累积了导致EGFP功能丧失的缺失和突变。


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