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菜豆金黄花叶病毒属病毒在烟粉虱体内复制及免疫逃逸机制

王雨蒙  
【摘要】:烟粉虱Bemisia tabaci是一类植食性刺吸式口器昆虫,目前被认为是一个包含数十个隐存种的隐存种复合群。菜豆金黄花叶病毒属包含400多种病毒,是植物病毒中最大的一个属。该属病毒对世界范围内多种经济作物的生产造成严重危害,且均由烟粉虱以持久性方式传播。近年来不断有证据支持一些菜豆金黄花叶病毒属病毒可以在烟粉虱体内复制和转录,但其分子机制还不清楚。为了更好地传播和扩散,病毒往往与介体昆虫间形成复杂的互作网络以实现对介体免疫系统的抑制。然而,菜豆金黄花叶病毒属病毒对烟粉虱免疫系统的影响还很不清楚。本论文以菜豆金黄花叶病毒属的tomato yellow leaf curl virus(TYLCV),tomato yellow leaf curl China virus(TYLCCNV)和papaya leaf curl China virus(Pa LCu CNV)为对象,针对这些重要问题开展研究,结果如下:1)TYLCCNV基因间隔区对其在烟粉虱体内复制的影响菜豆金黄花叶病毒属病毒的基因间隔区对于病毒在植物中的复制与转录至关重要。为探究病毒基因间隔区对其在烟粉虱体内复制的影响,我们将已证明可以在烟粉虱体内复制的TYLCCNV的基因间隔区替换为不能复制的Pa LCu CNV的基因间隔区,构建了突变的TYLCCNV(m TYLCCNV)。烟粉虱可以高效的获取和传播TYLCCNV和m TYLCCNV。然而,在烟粉虱获取病毒之后将其转移至病毒非寄主植物棉花上持毒的期间,烟粉虱体内TYLCCNV的量会先升高然后降低,而m TYLCCNV的量则持续降低,说明m TYLCCNV不能在烟粉虱体内复制。传毒实验表明,烟粉虱传播m TYLCCNV的效率显著低于TYLCCNV,说明病毒在烟粉虱体内的复制可以促进烟粉虱对病毒的传播。综上,这些结果表明菜豆金黄花叶病毒属病毒的基因间隔区对其在烟粉虱体内复制具有重要作用。2)与TYLCCNV基因间隔区互作的烟粉虱蛋白的鉴定鉴于菜豆金黄花叶病毒基因间隔区对其在烟粉虱体内复制的重要作用,我们推测一些烟粉虱蛋白通过与病毒基因间隔区互作来参与病毒在烟粉虱体内的复制和转录。因此,我们分别将TYLCCNV基因间隔区右侧区域的病毒链序列及左侧区域的互补链序列克隆到酵母单杂交的诱饵载体上,筛选与其互作的烟粉虱蛋白。经过筛选,我们鉴定到了52个与TYLCCNV基因间隔区互作的烟粉虱蛋白。随后,我们挑选了32个蛋白进行进一步的验证,并最终确定了12个与TYLCCNV基因间隔区互作的烟粉虱蛋白。接下来,我们挑选了5个具有转录调控功能的蛋白(HES1、Max、NOL11、ADA3-A和HSF)进行RNAi实验。沉默Bt HES1、Bt NOL11、Bt ADA3-A或Bt HSF后,烟粉虱体内病毒量显著降低,表明这些基因可能参与了病毒在烟粉虱体内的复制。3)菜豆金黄花叶病毒在烟粉虱体内复制的机制沉默Bt HES1或Bt HSF后,烟粉虱体内病毒量下降的较多。因此,为了进一步明确TYLCCNV在烟粉虱体内复制的机制,我们对这两个基因在病毒复制中的作用进行了深入探究。研究结果表明Bt HES1蛋白可以与位于TYLCCNV基因间隔区右侧区域的CACGTG元件互作并激活下游基因的转录。沉默Bt HES1可以有效抑制TYLCCNV在烟粉虱体内的转录和复制,并降低病毒的传播效率。因此,转录因子Bt HES1可能通过结合病毒的基因间隔区来激活病毒基因的转录从而促进病毒的复制和传播。此外,Bt HSF蛋白可以与TYLCCNV基因间隔区左侧区域互作。沉默Bt HSF也可有效抑制TYLCCNV在烟粉虱体内的复制并降低病毒传播效率。更重要的是,我们发现Bt HSF还可与TYLCV的基因间隔区互作并促进TYLCV在烟粉虱体内的复制。4)TYLCV与烟粉虱JAK/STAT通路的相互作用为揭示双生病毒与烟粉虱互作的分子机制,实验室前人以TYLCV coat protein(CP)蛋白为诱饵进行酵母双杂,筛选到了烟粉虱STAT转录因子(BtSTAT)。本研究首先验证了TYLCV CP与BtSTAT的互作。之后,我们鉴定了烟粉虱JAK/STAT信号通路的关键组分:DOME、JAK和STAT,并找到了4个BtSTAT的下游基因:Bta03341、Bta09750、Bta12654和Bta12955。通过饲喂ds RNA或抑制剂SH-4-54抑制JAK/STAT通路后,烟粉虱体内病毒基因组DNA以及CP的量均显著升高,说明烟粉虱JAK/STAT通路可以抑制TYLCV在烟粉虱体内的积累。此外,RNAi干扰BtSTAT下游基因Bta03341或Bta09750的表达可导致烟粉虱体内的病毒量升高,说明这两个基因是烟粉虱JAK/STAT通路下游的抗病毒因子。更重要的是,我们发现TYLCV的侵染抑制了烟粉虱的JAK/STAT通路。TYLCV CP与BtSTAT的互作在TYLCV抑制烟粉虱JAK/STAT通路的过程中发挥了重要的作用。综上所述,本研究证明了双生病毒基因间隔区对其在烟粉虱体内复制的重要影响,并初步解析了可能的作用机制。此外,本研究发现了烟粉虱JAK/STAT信号通路具有抗双生病毒的作用,而病毒则通过与转录因子STAT互作来抑制该通路的活性从而促进其在烟粉虱体内的存留和传播。这些结果揭示了双生病毒与介体烟粉虱之间复杂的共进化关系,为深入理解病毒与介体昆虫之间的相互作用关系以及研发新的病毒病防控技术提供了参考。


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