烟粉虱内共生菌多样性及一个Rickettsia新种的鉴定和功能研究

【摘要】：共生关系在自然界普遍存在,内共生菌与宿主昆虫构成了一种常见的共生关系。根据与宿主共生关系的密切程度,可以将内共生菌分为原生内共生菌和次生内共生菌。原生内共生菌为宿主提供必需氨基酸等营养物质,对宿主的生存至关重要;而次生内共生菌可以为宿主提供营养,也会对宿主的适合度、抗逆性和传毒能力等产生影响。半翅目昆虫烟粉虱是多种内共生菌的宿主,它是一个包含至少55个隐存种的复合群,其中一些隐存种如Middle East-Asia Minor 1、Mediterranean、Asia Ⅱ 1、Sub-Saharan Africa 1等对农业生产构成极大威胁。明确烟粉虱各隐存种的内共生菌多样性是阐明内共生菌如何影响宿主生物学特性的基础。二代测序技术已广泛应用于微生物多样性的研究,与二代测序技术相比,三代测序技术对微生物的鉴定更为精确,但成本较高,目前应用较少。为了加深对烟粉虱内共生菌多样性的认识,我们收集了来自亚洲、欧洲、非洲、大洋洲、美洲的21个隐存种和国内的36个田间烟粉虱样品,分别使用三代和二代测序技术探索了内共生菌多样性,还从中鉴定出一种新的内共生菌,并对其生物学功能进行了初步探索。1)烟粉虱内共生菌多样性研究使用三代测序技术,在21个隐存种中检测到了1种原生内共生菌和7个属的次生内共生菌,并且将其鉴定到种的水平。与二代测序技术相比,三代测序技术分辨不同种的能力更强,不仅在属的水平上补充了各隐存种内共生菌种类的信息,还检测到了4种新的Arsenophonus菌和1种新的Rickettsia菌。对于同一个隐存种,有些内共生菌仅出现在特定地理种群中,说明内共生菌多样性在同一隐存种的不同种群中也有差异。除内共生菌外,还发现一些疑为肠道微生物的细菌,并验证了其中一种Halomonas菌在烟粉虱中肠中的存在。2)Rickettsia菌一个新种的发现使用三代测序技术新发现一种Rickettsia菌。该菌在分类地位上明显区别于已报道的唯一一种烟粉虱Rickettsia内共生菌。田间调查结果显示,该菌仅分布于广东省肇庆市附近区域的Asia Ⅱ 1和Asia II 7隐存种中。荧光原位杂交和透射电镜结果表明该菌分布于Asia II 7多种器官的细胞内,并且可以和多数内共生菌一样经卵垂直传播给后代。基因组测序分析结果表明,该菌是一个新种。3)Rickettsia菌一个新种的功能探究该Rickettsia菌的宿主Asia Ⅱ 1烟粉虱是棉花曲叶病毒的重要传播媒介,该菌对Asia Ⅱ 1传毒能力的影响非常值得探索。带有和不带该菌的两个Asia Ⅱ 1种群在棉花、番茄、烟草三种植物上的适合度都没有明显差异;在获毒达到一定时长的条件下会体现出传毒率的差异,获毒48小时后,带菌种群的传毒率略高于不带菌的种群。使用GST pull-down联合质谱分析找到了一个可能和病毒外壳蛋白互作的Rickettsia菌的分泌蛋白Bt R242,并使用酵母双杂交和GST pull-down验证了Bt R242和病毒的互作。在烟粉虱获毒之后,该蛋白编码基因的表达水平明显下降,这或许是该菌没有在很大程度上提高传毒效率的原因。综上所述,我们使用三代测序和二代测序技术调查了烟粉虱多个隐存种和多个地理种群的内共生菌多样性,在内共生菌种和属的水平上丰富了对烟粉虱内共生菌种类和分布的认识。发现了一种新的Rickettsia内共生菌,并且描述了该菌的地理分布、宿主范围、在宿主体内的分布特性及其基因组特性等。通过初步探索该菌的生物学功能,发现该菌对宿主的适合度没有明显影响,对传毒效率的影响也比较小,又考虑到其宿主分布范围比较小,我们推断该菌目前对烟粉虱田间种群的数量消长和危害性没有重要影响。