乳粉生产系统细菌生物被膜污染特征及形成机理研究

【摘要】：细菌生物被膜,是由附着于惰性或活性实体表面的细菌细胞及其分泌的水合性胞外聚合物所组成的结构性细菌群落。由于胞外聚合物可增强细菌对外界环境因素的抵抗能力,使得常规杀菌方法不能实现彻底有效地灭菌。食品工业中,食源性致病菌和腐败菌容易粘附在食品生产系统的设备和环境表面形成细菌生物被膜,可能成为严重的潜在污染源。目前,关于乳制品生产加工过程中细菌生物被膜的相关研究报道已有很多,但大多集中于巴氏杀菌乳等液态乳的生产过程中细菌生物被膜的形成和成品包装中的细菌污染特征。然而,关于乳粉生产系统中生物被膜污染特征的研究鲜有报道。因此,本论文以乳粉生产系统中残留细菌生物被膜为研究对象,借助转录组学等技术手段,开展细菌生物被膜形成能力、碳源影响因子及其代谢机制的研究。主要研究内容和结果如下:1.乳粉生产系统残留细菌污染的多样性和分布差异性研究对原位清洗(Clean in place,CIP)后乳粉生产系统的11个采样点进行残留细菌污染特征考察,并采用16S r DNA测序技术对其进行分子生物学鉴定。结果表明,残留细菌具有丰富的多样性,鉴定到的45株菌株分别归于不动杆菌属(Acinetobacter,8株)、芽胞杆菌属(Bacillus,22株)、梭杆菌属(Clostridium,1株)、肠杆菌属(Enterobacter,2株)、细杆菌属(Microbacterium,1株)、微球菌属(Micrococcus,2株)、莫拉氏菌属(Moraxella,2株)、假单胞菌属(Pseudomonas,2株)、沙雷氏菌属(Serratia,3株)和葡萄球菌属(Staphylococcus,2株)。其中,革兰氏阳性菌中芽胞杆菌属丰度最高,约为78%;革兰氏阴性菌中不动杆菌属丰度最高,约为47%。同时,残留细菌具有明显的分布差异性:占比最高的是储存罐,约为47%;其次是巴氏杀菌板式热交换器,约为18%。2.乳粉生产系统残留细菌的生物被膜形成能力及其影响因子研究以分离得到的残留细菌菌株为研究对象,采用结晶紫染色法和平板计数法考察其在乳粉生产设备材料AISI 304不锈钢表面的生物被膜形成能力及对CIP处理的耐受性,结果表明所有分离菌株均能在不锈钢表面形成生物被膜(OD_(570)0.067)。与浮游细菌相比,生物被膜状态细菌对CIP处理的耐受性显著增强,说明细菌通过形成生物被膜而使CIP处理的有效性降低,从而残留在生产设备和连接管道表面。此外,菌株在热碱处理后的D值高于其热酸处理后的D值,表明菌株对热碱处理的耐受性强于对热酸处理的耐受性,可使用热酸处理减少耐热碱处理菌株的定殖。采用结晶紫染色法进一步考察不同孵育环境(例如营养物质、温度等)对菌株生物被膜形成能力的影响。结果表明,分离菌株的生物被膜形成能力受到自身遗传特性、温度、可获得性营养和接触面表面特性的共同调控,并且调控效果尚无同一规律可循。3.不同碳源对地衣芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌生物被膜形成和代谢的影响研究以37℃时在不锈钢表面具有强生物被膜形成能力的地衣芽胞杆菌(Site 1EF105377 Bacillus licheniformis)和蜡样芽胞杆菌(Site 3 AJ577290 Bacillus cereus)菌株为研究对象,采用结晶紫染色法和CCK-8法考察不同碳源(葡萄糖、麦芽糖、乳糖和脱脂牛奶)对其生物被膜形成能力和代谢活性的影响。结果表明,地衣芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌能够在营养肉汤培养基和所有添加了碳源的营养肉汤培养基中形成生物被膜(OD_(570)0.067);葡萄糖和麦芽糖均能显著提高(p0.05)地衣芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌生物被膜的生物量和代谢活性;脱脂牛奶能显著提高(p0.05)地衣芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌生物被膜的生物量和地衣芽胞杆菌生物被膜的代谢活性,而乳糖只能显著提高(p0.05)地衣芽胞杆菌生物被膜的代谢活性,这表明乳糖不是脱脂牛奶中主要影响地衣芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌生物被膜形成能力的组分。4.不同碳源条件下地衣芽胞杆菌生物被膜形成和发育过程中的碳代谢重塑以添加不同碳源(葡萄糖、麦芽糖、乳糖和脱脂牛奶)所形成的地衣芽胞杆菌生物被膜为研究对象,采用Illumina Hiseq高通量测序技术,考察地衣芽胞杆菌生物被膜状态细菌基因转录水平的变化,并对显著富集的差异表达基因表达情况进行了具体分析。结果表明,差异表达基因涉及的通路主要有氨基酸代谢、丙酮酸代谢、肌醇代谢、脂肪酸代谢、鞭毛组装与细菌趋化性等。不同碳源条件下地衣芽胞杆菌生物被膜状态细菌三羧酸循环的碳通量均减少,但代谢调控途径不同。(1)葡萄糖添加组丙酮酸通过支链氨基酸代谢途径合成乙偶姻的相关酶基因表达大都上调;(2)麦芽糖添加组肌醇和脂肪酸分解代谢生成乙酰辅酶A的相关酶基因表达大都下调;(3)乳糖添加组脂肪酸分解代谢生成乙酰辅酶A的相关酶基因表达大都下调;(4)脱脂牛奶添加组支链氨基酸降解为乙酰辅酶A的相关酶基因表达大都下调,而乙酰辅酶A合成脂肪酸的相关酶基因表达大都上调。因此,乙酰辅酶A生成量减少,细菌进入三羧酸循环的碳通量减少,从而导致生物被膜胞外多糖合成途径的碳通量相对增加,进而使生物被膜生物量的形成增加。此外,地衣芽胞杆菌对葡萄糖的利用率最高,葡萄糖添加组中鞭毛组装与趋化通路的相关酶基因表达大都上调,生物被膜率先进入扩散阶段。5.不同碳源条件下蜡样芽胞杆菌生物被膜形成和发育过程中的碳代谢重塑以添加不同碳源(葡萄糖、麦芽糖、乳糖和脱脂牛奶)所形成的蜡样芽胞杆菌生物被膜为研究对象,采用Illumina Hiseq高通量测序技术,考察蜡样芽胞杆菌生物被膜状态细菌基因转录水平的变化,并对显著富集的差异表达基因表达情况进行了具体分析。结果表明差异表达基因涉及的通路主要有糖酵解与磷酸戊糖途径、三羧酸循环、氨基酸代谢和脂肪酸代谢等。不同碳源条件下蜡样芽胞杆菌生物被膜状态细菌通过糖酵解或磷酸戊糖途径储备的丙酮酸含量均增加,但是进入三羧酸循环的碳通量均没有增加,因此生物被膜胞外多糖合成途径碳通量可能增加,从而导致生物被膜生物量的形成增加。(1)葡萄糖添加组丙酮酸通过支链氨基酸代谢途径合成乙偶姻的相关酶基因表达大都上调;(2)麦芽糖添加组丙酮酸合成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸合成的相关酶基因表达大都上调;(3)乳糖添加组丙酮酸通过支链氨基酸代谢途径合成乙偶姻的相关酶基因表达大都上调;因此,三组样本中乙酰辅酶A的生成量减少,进入三羧酸循环的碳通量减少;(4)脱脂牛奶添加组通过糖酵解途径生成的丙酮酸含量增加,但是三羧酸循环代谢能力没有显著变化。以上结果有助于今后开展靶向研究,为更有效的控制乳粉生产系统中的生物被膜奠定了理论基础。