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杨梅叶原花色素基于调控淀粉消化吸收和肝糖代谢的降血糖作用机制

王梦婷  
【摘要】:近年来,一些天然来源的原花色素提取物被陆续发现具有降血糖活性且毒副作用低,但相关机制研究尚不完善,缺乏系统性。此外,目前研究的原花色素集中于以儿茶素为结构单元的原花青素类,如葡萄籽原花色素,存在原料获取繁琐、价格昂贵等局限性。而杨梅叶原花色素(proanthocyanidins from bayberry(Morella rubra Sieb.et Zucc.)leaves,BLPs)是从杨梅叶片中分离提取出的一种以EGCG为基本结构单元的原飞燕草素类原花色素,其中棓酸酯化的结构单元占比98%以上,具有来源丰富、易获取等优点。杨梅叶原花色素的独特结构可能使其具备更强的降血糖活性,还有待深入研究。因此,本文利用体外模拟消化模型、Caco-2细胞和Hep G2细胞模型、高糖膳食诱导胰岛素抵抗果蝇模型,从降低血糖生成和增加血糖利用两个维度,系统地研究了杨梅叶原花色素在淀粉消化-小肠葡萄糖吸收转运-肝糖代谢进程中的降血糖作用及相关机制。主要研究结果如下:(1)杨梅叶原花色素对淀粉理化性质、结构及消化性的影响基于体外模拟消化模型,发现0.5%-5.0%添加量的BLPs可抑制体外淀粉酶解率,并将RDS含量从34.58%降低至5.50%-12.44%,将RS含量从31.29%提高至56.84%-69.71%,BLPs对淀粉消化性的抑制能力强于其他三种市售原花色素(葡萄籽、花生红衣、松树皮来源)。进一步地,通过碘量法和静态流变学实验确认了BLPs能与淀粉尤其是直链淀粉结合。分析DSC、XRD、FTIR、SEM和CLSM的实验结果可知,BLPs与淀粉的非共价相互作用会降低淀粉的热稳定性和分子有序性、改变淀粉链的分布和排列、破坏淀粉的结晶结构,从而影响淀粉的消化性。(2)杨梅叶原花色素对淀粉消化酶活性的影响及其相互作用体外酶动力学实验结果表明,BLPs是α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的混合型抑制剂,IC_(50)值的阿卡波糖当量分别为2.92 mmol AE/g和517.01 mmol AE/g。通过荧光光谱和热力学分析确认了BLPs与两种酶之间的静态荧光淬灭机制和非共价相互作用。分析同步荧光光谱、三维荧光光谱、圆二色谱、红外光谱和分子对接的实验结果可知,BLPs能与淀粉消化酶中的氨基酸残基(Tyr、Trp)结合,改变其所处微环境的极性,还能改变酶的二级结构(增大β/α比例),增大多肽链错误折叠几率,破坏酶的天然构象,解释了BLPs降低淀粉消化酶活性的原因。(3)杨梅叶原花色素对小肠葡萄糖吸收转运的调控作用及分子机制利用透析法和Caco-2细胞葡萄糖吸收模型,发现BLPs能显著抑制葡萄糖扩散能力和Caco-2细胞葡萄糖吸收能力。通过构建自行分化的Caco-2细胞单层模型模拟空腹和餐后状态下的小肠葡萄糖跨膜转运过程,当转运120 min时,100μg/m L的BLPs将葡萄糖跨膜转运量分别降低了30.41%和41.49%。分析q PCR和western-blot的实验结果可知,BLPs能显著下调GLUT2和SGLT1的基因和蛋白表达,以及显著降低PLC和PKC的转录水平,说明BLPs对小肠葡萄糖吸收转运的抑制机理是抑制葡萄糖转运体的表达和活性,并与PLC-PKC途径有关。(4)杨梅叶原花色素对肝糖代谢的调控作用及分子机制建立胰岛素抵抗的Hep G2细胞模型,并结合分子生物学方法,探究BLPs对肝糖代谢的分子调控机制。结果表明,BLPs能基于PI3K/AKT-GSK3β-GYS2路径促进肝糖原合成,100μg/m L的BLPs干预不仅使Hep G2细胞内糖原合成量增加了50.06%,还可将IR-Hep G2细胞的糖原合成量恢复至正常水平;此外,BLPs能基于PI3K/AKT-FOXO1-PEPCK/G6Pase路径抑制肝脏糖异生作用,相比于空白对照组和IR模型对照组,100μg/m L的BLPs干预使PEPCK酶活分别降低37.69%和49.90%,而使G6Pase酶活分别降低51.64%和48.03%。由此可知,BLPs能增强肝细胞的葡萄糖利用能力,并改善胰岛素抵抗。(5)基于高糖膳食诱导胰岛素抵抗果蝇模型验证杨梅叶原花色素的降血糖作用用含30%蔗糖的高糖饲料喂养果蝇21天,可成功诱导胰岛素抵抗果蝇模型(记为HSD果蝇)。而BLPs干预(1-5 mg/m L)21天后,HSD果蝇的体质量最大减轻10.73%、总血糖和甘油三酯水平最大降低46.78%和59.01%、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性最大降低27.79%和51.55%、糖脂代谢基因的表达异常现象改善(dilp2、dilp3、In R、d AKT、d TOR、d FOXO、PEPCK、MAPK、SREBP、FAS、E78和LSD基因表达下调)。说明BLPs可以有效缓解高糖膳食诱导胰岛素抵抗果蝇的生理指标紊乱、消化功能紊乱和糖脂代谢紊乱等一系列不良症状。以上研究结果综合阐释了杨梅叶原花色素的降血糖作用机制,为后续研发降血糖天然药物或功能性食品奠定理论基础,从而提高杨梅副产物的再利用价值。


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