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转录因子BoaMYB51和BoaBIM1调控芥蓝吲哚族芥子油苷代谢机理及其功能研究

王梦雨  
【摘要】:芥子油苷是一类主要存在于十字花科植物中的含氮含硫的植物次生代谢物质。芥子油苷的生物学功能非常广泛,不仅可以帮助植物抵御病原菌侵袭、防御昆虫及提高自身免疫,而且其自身及降解产物具有较强的抗癌活性。芸薹属蔬菜是我国蔬菜产业的重要组成部分。芥子油苷在芸薹属蔬菜中含量丰富,其不仅影响芸薹属蔬菜的风味和营养,而且在抵御蔬菜重要病害如黑斑病等中发挥重要的作用。目前,在模式植物拟南芥中芥子油苷生物合成途径和调控网络的研究已经较为深入,而在作物中研究较少。我国特产的甘蓝类蔬菜——芥蓝中芥子油苷种类和含量丰富,是芸薹属蔬菜中研究芥子油苷代谢调控网络的良好材料。本论文以芥蓝为材料,综合运用分子生物学、生理学、遗传学、基因组学等手段探究了吲哚族芥子油苷代谢途径的转录调控机制。主要研究结果如下:1.VIGS沉默BoaMYB51降低了芥蓝黑斑病抗性。本论文中利用virus-induced gene silencing(VIGS)技术获得了转录因子BoaMYB51基因沉默材料。通过接种芸薹链格孢孢子悬浮液进行侵染发现,BoaMYB51-VIGS的芥蓝叶片接种后菌斑面积及菌斑溶于水后的孢子浓度均显著高于对照叶片。结果表明,在芥蓝响应芸薹链格孢侵染的过程中,BoaMYB51参与正向调控芥蓝对黑斑病的抗性。2.BoaMYB51过表达促进芥蓝中吲哚族芥子油苷的合成。为了验证芥蓝中BoaMYB51的功能,通过遗传转化和VIGS技术获得了芥蓝BoaMYB51转基因材料和基因沉默材料。芥子油苷组分和含量分析结果显示,各吲哚族芥子油苷组分的含量在BoaMYB51基因沉默材料中均显著低于对照,而在芥蓝BoaMYB51基因过表达材料中均显著高于对照。相对应的,芥子油苷生物合成关键基因表达分析结果表明,BoaMYB51基因沉默材料中吲哚族芥子油苷生物合成关键基因BoaCYP79B2、BoaCYP79B3、BoaCYP83B1等均受到显著下调,而在BoaMYB51基因过表达材料中则显著上调。以上结果表明,BoaMYB51正向调控芥蓝中吲哚族芥子油苷的生物合成。3.bHLH类转录因子BoaBIM1与BoaMYB51互作。利用酵母双杂交筛选芥蓝cDNA文库,筛选到30个可能与BoaMYB51存在互作关系的蛋白,其中包括转录因子、核定位的调控蛋白、参与蛋白调控的蛋白以及功能未知的蛋白。之后对鉴定到的bHLH类转录因子BoaBIM1与BoaMYB51进行了酵母双杂交点对点验证,以及pull-down实验的进一步蛋白互作验证。在芥蓝中,共鉴定到两个BoaBIM1基因,氨基酸比对和进化树分析表明,BoaBIM1与At BIM1有较高的同源性。利用烟草瞬时表达系统对BoaBIM1蛋白进行亚细胞定位分析发现,其定位于细胞核中。芥蓝不同组织器官及芥蓝幼苗不同生长时期的表达模式分析显示,BoaBIM1在嫩叶、花、茎和根中表达量较高,而在角果中表达量很低。除此之外,芥蓝各组织器官中BoaBIM1.1的表达量均显著高于BoaBIM1.2。4.BoaBIM1转录调控吲哚族芥子油苷的生物合成。为了验证芥蓝中BoaBIM1的功能,利用VIGS基因沉默技术获得了BoaBIM1-VIGS的芥蓝材料。芥子油苷组分和含量分析结果表明,不同的BoaBIM1-VIGS芥蓝株系中吲哚族芥子油苷各组分的含量均显著低于对照。相比于对照,BoaBIM1-VIGS芥蓝植株中吲哚族芥子油苷重要转录因子BoaMYB51.1的基因表达量显著下降,而BoaMYB51.2的基因表达量则没有明显变化;吲哚族芥子油苷合成途径的关键酶基因表达均明显下降,其中以BoaCYP79B2.2和BoaSUR1.1下降最为显著。通过农杆菌浸花法获得了拟南芥BoaBIM1基因过表达植株,进一步测定了芥子油苷含量和芥子油苷合成相关基因表达量。在BIM1及其同源基因都缺失的三突突变体bim123中,各吲哚族芥子油苷组分含量显著低于野生型,而BoaBIM1.1过表达株系Col-035S:BoaBIM1.1和BoaBIM1.2过表达株系Col-035S:BoaBIM1.2中各吲哚族芥子油苷组分含量都显著高于野生型。与野生型拟南芥相比,突变体bim123中吲哚族芥子油苷的重要调节基因At MYB51及合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1、CYP81F2、SUR1表达量均显著下降,而BoaBIM1过表达植株中则显著升高。说明在拟南芥中BIM1对吲哚族芥子油苷途径相关的基因有正向调控作用。染色体免疫共沉淀实验结果表明,BIM1能够直接结合到吲哚族芥子油苷合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1、CYP81F2启动子的E-box上发挥作用。综上所述,本论文在芥蓝中揭示了BoaMYB51转录调控吲哚族芥子油苷合成的机制,并发现其正向调控芥蓝对黑斑病的抗性;筛选到BoaMYB51的互作蛋白——bHLH类转录因子BoaBIM1,发现BoaMYB51和BoaBIM1可能形成蛋白复合体,共同转录调控吲哚族芥子油苷相关基因的表达。本研究不仅在理论上丰富了芸薹属蔬菜中吲哚族芥子油苷的代谢调控网络和生物学功能,也为芸薹属蔬菜重要真菌病害黑斑病的控制提供了新的策略。


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