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水稻抗铝基因ArPK的克隆及其抗铝机制的研究

刘相培  
【摘要】:铝毒害是酸性土壤中影响植物生长的主要限制因子之一。水稻是禾谷类作物中抗铝毒能力最强的植物,虽然以ART1(Aluminum Resistance Transcription factor1)为核心调控因子的抗铝机制已得到了较为全面的阐述,但是否存在独立于ART1途径的抗铝机制仍有待探索。氮是植物生长必须的大量元素之一,但氮肥长期过量施用会导致土壤酸化,进而提高土壤中铝的活度,引起铝毒害,而氮营养是否会通过体内代谢物影响水稻的抗铝性仍不清楚。为了挖掘新的水稻抗铝基因,我们通过筛选籼稻特青(Oryza sativa indica cv.Teqing)EMS突变体库,获得了一个铝敏感突变体。通过Mut Map基因定位、生理分析、转录组分析和转基因功能验证等方法,明确是一个蛋白激酶的突变导致了铝敏感表型,并发现该激酶直接影响了与氮代谢和铝敏感性密切相关的多胺合成途径。具体结果如下:1.定位于细胞膜及细胞核的激酶蛋白Ar PK突变导致arpk专一对铝敏感从水稻EMS库筛选获得的铝敏感突变体在5μM Al处理下就表现出明显的根伸长抑制表型,但对Cd~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、La~(3+)等重金属离子及不同p H处理的响应与野生型无显著差异,说明该突变对铝毒响应具有专一性。通过基于BSA的Mut Map发现编码一个未知功能的激酶候选基因,将此基因回转入该突变体,铝敏感表型得到很好的回复,说明该基因直接参与了水稻抗铝调控,故将此基因命名为Ar PK(Aluminum related Protein Kinase)。通过GUS染色及基因表达检测,发现此激酶在高铝浓度短时间处理(50μM,3 h)或低浓度长处理时间(20μM,24 h)下显著诱导表达。通过原位免疫荧光染色及烟草瞬时表达实验发现此激酶同时定位于质膜和细胞核。在arpk中调控水稻抗铝性的关键转录因子ART1及其下游抗铝基因的表达与野生型无显著差异,而art1突变体中,Ar PK的表达受铝诱导上调。上述结果表明,Ar PK参与独立于ART1的水稻抗铝性调控途径。2.水稻中NAOGAc T可能补偿NAOD的功能在转录组分析中,发现一个编码乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因(NAOD,N-acetylornithine deacetylase)的表达在arpk突变体中组成型抑制,但用Ca MV35S启动的NAOD转入arpk中后,不能回复突变体的铝敏感表型,表明NAOD转录抑制不是导致突变体arpk对铝敏感的原因。NAOD是鸟氨酸合成线性途径的依赖酶,参与催化N-acetyl-Orn转化为鸟氨酸(Ornithine,Orn)的过程。鉴于部分原核生物与植物中存在鸟氨酸合成的循环途径,通过分析我们发现,突变体arpk中鸟氨酸合成的循环途径中可催化乙酰鸟氨酸通过转乙酰基作用生成Orn的N-乙酰鸟氨酸:谷氨酸转乙酰基酶(N-acetylornithine:glutamate acetyltransferase,NAOGAc T)正常表达,且铝处理可诱导NAOGAc T表达上调。此外,高铵处理可明显缓解突变体arpk铝敏感性,而高铵加铝处理也使得突变体arpk中NAOGAc T比单独铝处理有更高的表达。上述结果表明,水稻中同时存在鸟氨酸合成的线性途径和循环途径,且在一定条件下NAOGAc T可以补偿NAOD的功能。3.突变体arpk中精氨酸代谢中Put合成紊乱影响其抗铝性转录组分析发现,突变体arpk中精氨酸(Arginine,Arg)代谢途径中NAOD催化合成Orn后的下一催化步骤所需鸟氨酸脱羧酶的编码基因ODC1(Ornithine decarboxylase 1)的表达却受铝专一性诱导显著上调,推测Ar PK可能具有抑制ODC1基因表达的功能。ODC催化Orn合成腐胺(Putrescine,Put),而Put是一种具有多种功能的分子,参与多种植物胁迫响应。分析发现,铝处理后突变体arpk中三种形态的Put(游离态、结合态及束缚态)的含量均明显提高,且均显著高于野生型。有意思的是,添加ODC抑制剂DFMO(Difluoromethylornithine;Eflornithine)可解除突变体arpk中NAOD的转录抑制,且arpk的铝敏感表型得到回复,表明arpk中NAOD的转录抑制可能是对激酶基因Ar PK突变导致其对ODC1抑制解除后的负反馈,而ODC1表达上调引起的Put过量积累是导致arpk对铝敏感的原因。水稻中Put的生物合成还同时存在ADC(Arginine decarboxylase)途径。虽然野生型中ADC2在转录水平对铝响应,但外源添加ADC的抑制剂DFMA后野生型根长仅出现轻微抑制,添加D-Arg(D-Arginine)后野生型根伸长没有变化,由此可见,ADC2在水稻抗铝中可能扮演有限的角色,而稳定调控经ODC途径的多胺合成才是水稻抗铝的基本策略。4.铵通过增加其同化及抑制ODC1转录减少Put合成而提高突变体arpk抗铝性我们进一步分析了高铵处理缓解铝毒的原因,发现高铵加铝处理增加氨同化GS/GOGAT(Glutamine synthetase/Glutamine oxoglutarate aminotransferase)途径及精氨酸合成途径中多数基因的表达,但抑制了多胺合成中ODC1,ADC2及SAMDC1(S-adenosylmethionine decarboxylase 1)等基因的表达。说明在突变体arpk中高浓度的NH_4~+一方面可能通过抑制突变体arpk中ODC1的转录,降低Put的合成与积累,另一方面可能通过加强NH_4~+同化而增加胞内氨基酸(Glu,Gln等)及其他与水稻抗铝相关的物质含量以提高其抗铝能力,两方面的共同作用缓解了突变体arpk中的铝毒害。


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