基于乳清分离蛋白的载体材料构建及对功能因子的稳态作用研究

【摘要】：乳清分离蛋白(WPI)常作为载体材料构建传递体系来包埋和保护食品功能因子,以提高其理化稳定性和生物利用率。但是,以蛋白质构建的传递体系对环境条件(p H、高温和离子浓度等)较敏感,限制了其在食品工业中的广泛应用。以改性蛋白质作为载体材料是克服此不足的一种有效方法。多糖和多酚的共价接枝能够赋予蛋白质新的功能性质,对构建高理化稳定性的传递体系具有重要意义。本研究以WPI、阿拉伯胶(GA)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为研究对象,采用不同方法制备二元或三元共价复合物,表征其结构和理化特性,并将这些共价复合物用于构建纳米复合物和纳米乳液传递体系,评价其对食品功能因子的稳态作用。主要研究内容和结论如下:(1)以干法糖基化制备WPI-GA共价复合物,发现反应1、3、5和7 d时共价复合物的接枝度分别为28.14%、44.98%、49.50%和51.20%,且接枝度越高褐变越严重。GA的共价连接使WPI二级结构中α-螺旋含量降低,无规卷曲含量增加,蛋白质荧光强度和表面疏水性降低。糖基化能改善WPI的热稳定性、溶解性和乳化性,但共价复合物的溶解性和乳化性分别在反应1和5 d时达到最佳,说明具备最佳功能性质的糖基化WPI的接枝度不一定是可获得的最高水平。(2)以超声辅助制备WPI-GA共价复合物,发现超声处理能明显提高WPI的糖基化速率,在优化条件下(超声温度70 ~oC,超声功率500 W,初始p H 11.0,蛋白质浓度10.0 mg/m L和蛋白质-多糖质量比1:2)处理80 min即可获得同干法反应1 d相当的接枝度,且复合物褐变度较低。同干法制备的共价复合物相比,超声辅助制备的共价复合物分子量较小,二级结构中α-螺旋含量更低而无规卷曲含量更高,内源荧光强度和表面疏水性更高,空间结构更松散。结构上的差异使前者热稳定性和乳化稳定性较好,后者溶解性和乳化活性较好。(3)以WPI-GA共价复合物构建负载EGCG的纳米复合物传递体系,发现超声辅助糖基化会增强WPI同EGCG的结合能力,而干法糖基化则相反,因而超声辅助制备的共价复合物对EGCG负载率更高。基于多糖链的空间位阻作用,糖基化对EGCG诱导的蛋白质聚集有明显抑制作用,能够提高纳米复合物的多酚载量。同蛋白质形成纳米复合物对EGCG及其抗氧化活性均具有保护作用,而糖基化能增强这种作用,尤其是超声辅助糖基化。糖基化可以增强纳米复合物中EGCG的生物有效性,但不同方法糖基化对EGCG生物有效性的影响没有显著差异(p0.05)。总体而言,超声辅助制备的WPI-GA共价复合物更适合构建蛋白质-多酚纳米复合物传递体系。(4)以WPI-GA共价复合物稳定β-胡萝卜素纳米乳液,发现同WPI和WPI-GA混合物稳定的纳米乳液相比,共价复合物稳定的纳米乳液冻融稳定性、盐离子稳定性、热稳定性和酸碱稳定性及乳液中β-胡萝卜素的紫外光照稳定性和储藏稳定性更好。GA的共价连接可以提高WPI稳定的纳米乳液中β-胡萝卜素的生物有效性,但超声辅助制备的共价复合物稳定的纳米乳液中β-胡萝卜素的生物有效性低于物理混合物稳定的纳米乳液。同超声辅助制备的共价复合物稳定的纳米乳液相比,干法制备的共价复合物稳定的纳米乳液热稳定性更好,且β-胡萝卜素的生物有效性更高,因而更适合构建纳米乳液传递体系。(5)以碱法、自由基法和酶法制备WPI-EGCG共价复合物,并将其用于稳定β-胡萝卜素纳米乳液。发现酶法诱导接枝效率最高,其次为碱法。EGCG的共价接枝使WPI二级结构中α-螺旋含量减少,无规卷曲含量增加,蛋白分子荧光强度降低。碱法和酶法诱导的EGCG共价接枝会使WPI表面疏水性降低、热稳定性提高,而自由基法则相反。共价复合物的抗氧化活性明显增强,且同EGCG接枝量呈正比。同WPI相比,共价复合物作为乳化剂可以明显抑制乳液中β-胡萝卜素在紫外光照和储藏过程中的降解,这种抑制作用也同EGCG接枝量呈正相关。(6)在WPI-EGCG二元共价复合物基础上,采用干法美拉德反应制备WPI-EGCG-GA三元共价复合物,并将其用于稳定β-胡萝卜素纳米乳液。GA的共价连接使二元复合物热稳定性和抗氧化活性增强。同WPI、WPI-EGCG二元共价复合物和WPI-EGCG-GA三元混合物稳定的纳米乳液相比,WPI-EGCG-GA三元共价复合物稳定的纳米乳液显示更好的冻融稳定性、盐离子稳定性,热稳定性和酸碱稳定性,乳液中β-胡萝卜素的紫外光照和热稳定性明显增强,乳液中β-胡萝卜素的生物有效性显著提高。